DNA損傷部位ビオチン化キット

【はじめに】
　生物の遺伝情報を保持しているDNAは、複製時のDNA polymeraseのエラーに加えて、環境中の放射線や紫外線、またはアルキル化剤等の化学物質、生体内における活性酸素等の代謝産物等により損傷を受けます。これらのエラーや損傷が正しく修復されなければ、突然変異を誘発し、これが癌や老化の原因となります。
　DNA損傷部位には修復機構が働き、その一つとして塩基除去修復があります。この時 AP site（apurinic / apyrimidinic site）と呼ばれる塩基除去部位が出現します。つまりAP site の検出はDNA損傷部位を測定し得る有効な方法となります。
　ARP（N'-Aminooxymethylcarbonylhydrazino-D-biotin）はこのAP siteと特異的に結合し、ビオチン化できる試薬として知られています。ARP Kit は、ARPを用いてDNAをビオチン化し96穴マイクロプレートに固定化して検体DNA中のAP site を簡便に定量できるキットです。
　このキットには、AP site 数が既定された標準DNAが含まれており、既存のビオチン検出法を用いることによってAP site の定量ができます。

【測定原理】
1) 精製した検体DNAのAP site をARPで標識します。
2) 標準DNAと共にARP標識した検体DNAを96穴マイクロプレートに固相化します。
3) ARPはビオチン構造を持つため、酵素標識したアビジンで認識されます。
4) アビジンの標識酵素活性を利用し、酵素発色基質試薬で発色させます。吸光度を測定し、標準DNAより作成した検量線より検体DNAのAP site 数を定量します。

【キット内容】

●標準ARP-DNA （5 AP-sites/10,000nucleotides 0.2μg/ml）	3ml
●希釈用ARP-DNA （0 AP-sites/10,000nucleotides 0.2μg/ml）	3ml
●BSA（ブロッキング用）	0.8g
●PBS（BSA希釈用）	40ml
●ARP	3mg
●アミノプレート	1枚

【キット以外に必要な器具、試薬】
1) マイクロピペッター
2) マイクロプレートウォッシャー
3) 恒温槽
4) マイクロプレートリーダー
5) TE buffer（10 mM Tris , 1mM EDTA , pH7.5）
6) PBST（0.1％ Tween 20 in PBS）
7) ビオチン検出用試薬（ABC（Avidine-Biotin-POD complex）試薬など）
8) 発色基質試薬（OPD, SAT Blueなど）

【測定操作】
(1)検体DNAの標識
　精製した検体DNAをARPと反応させDNA中のAP-sitesを標識します。
　　　↓
(2)検量線作成用標準溶液の調製
　標準ARP-DNAと希釈用ARP-DNAを混合し検量線作成用の標準溶液を調製します。
　　　↓
(3)DNA溶液のプレートへの固相化（37℃、１時間）
　(1)(2)で調製したDNA溶液をアミノプレートに固相化します。
　　　↓
(4)プレート洗浄
　PBSTでプレートを洗浄します。
　　　↓
(5)BSA溶液でブロッキング（37℃、２時間）
　ビオチン検出用酵素試薬の非特異的吸着を防ぐため、BSA溶液をプレートに添加しプレート表面をブロッキングします。
　　　↓
(6)プレート洗浄
　　　↓
(7)ビオチン検出用試薬添加
　　　↓
(8)プレート洗浄
　　　↓
(9)発色基質溶液添加、発色
　　　↓
(10)発色停止、吸光度測定
　発色停止後、マイクロプレートリーダーで吸光度測定
　　　↓
(11)検量線作成
　標準DNAの吸光度測定結果より作成した検量線から検体DNA中のAP-site 数を求めます。

検量線作成例

【注意事項】
●このキットはARPによってDNA中のAP siteをビオチン化するキットです。よって、本キットで【測定操作】(5)）までが行なえます。
●ビオチン検出用酵素試薬としてABC試薬のほか、POD conjugated Avidin, ALP conjugated Avidin 等を使うことができます。試薬の濃度、発色試薬などの条件により、検出感度が異なります。
●測定感度はプレート間差、測定温度や発色の条件によっても異なってきます。そのため検体DNAと標準DNAの比較は同一プレート上で同時に行って下さい。

参考文献
1) A. Sancar, G. B. Sancar, Annu. Rev. Biochem., 57, 29-67（1988）.
2) T. Lindahl, B. Nyberg, Biochemistry, 11, 3610-3618（1972）.
3) M. Liuzzi, M. Talpaert-Borle, J. Biol. Chem., 260, 5252-5258（1985）.
4) M. Weinfeld, M. Lizzi, M. C. Paterson, Biochemistry, 29, 1737-1743（1990）.
5) B. X. Chen, K. Kubo, H. Ide, B. F. Erlanger, S. S. Wallace, Y. W. Kow, Mutat. Res., 273, 253-261（1992）.