生物の遺伝情報を保持しているDNAは、複製時のDNA polymeraseのエラーに加えて、環境中の放射線や紫外線、またはアルキル化剤等の化学物質、生体内における活性酸素等の代謝産物により損傷を受けます。これらのエラーや損傷が正しく修復されなければ突然変異を誘発し、これが癌や老化の原因となります。
DNA損傷部位には修復機構が働き、その一つとして塩基除去修復があります。この時AP site（apurinic / apyrimidinic site）と呼ばれる塩基除去部位が出現します。よってAP siteを検出することはDNA損傷部位を測定し得る有効な方法となります。
ARP（N'-Aminooxymethylcarbonylhydrazino-D-biotin）はこのAP siteと特異的に結合し、ビオチン化できる試薬として知られています。ARP Kitは、ARPを用いてDNAをビオチン化し96穴マイクロプレートに固相化して検体DNA中のAP siteを簡便に定量するキットです。
このキットには、AP site数が規定された標準DNAが含まれておりますので、既存のビオチン検出法を用いることによってAP siteの定量ができます。
| 標準ARP-DNA（5AP sites / 10,000 nucleotides, 0.2μg/ml） | 3ml |
| 希釈用ARP-DNA（0AP sites / 10,000 nucleotides, 0.2μg/ml） | 3ml |
| BSA（ブロッキング用） | 0.8g |
| PBS（BSA希釈用） | 40ml |
| ARP | 5mg |
| アミノプレート | 1枚 |
◎保存方法：冷蔵保存, 安定性：６ヶ月間（4℃保存）
プレートを右上図の様に標準DNAを用いた検量線用のエリアと、検体測定用のエリアにレイアウトして測定を行います。
このキットでは以下のレイアウトで最大14種類の検体が測定できます。ここでは、検体の測定について n=3 で設定しておりますが、n=6 とした場合はこのプレートで測定することができる検体数は７検体になります。また、このレイアウトでは周縁のウェルを使用しておりません。これは次頁に記載しております96穴マイクロプレート周縁効果を防ぐためです。
1) 検体DNAのAP site をARPで選択的に標識します。
2) ARP標識検体DNAと標準DNAを96穴マイクロプレートに固相化します。
3) ARPはビオチン構造を持つため、酵素標識したアビジンで認識されます。
4) アビジンの標識酵素活性を利用してAP site数を定量します。
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注意）
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この方法は、ウェルの底面に存在するアミノ基の陽イオン性を利用し、DNAを固相化します。よって短時間での固相化が可能ですが、他の検出試薬の非特異吸着を防ぐために、BSA等でのブロッキングを必要とします。キットに含まれるアミノプレートはコーニング・コースター製のものを使用しております。このプレートは、ストリップ型で１レーンずつ切り離して使用する事ができます。表面の活性を保つため、開封後は再び遮光、密閉して保存して戴きますよう、お願いいたします。
 96穴マイクロプレートを用いる場合、周縁効果（エッジ効果）を考慮しなければなりません。この効果は周縁のウェルと内側のウェルで熱勾配を生じて反応速度に差が生じる現象です。上図の様に周縁のウェル（点線で囲まれた部分）を用いない方が精度の高い測定ができます。 |
本キットの標準DNAの精製法は5章に記載しています。
検体DNAの精製法もこの方法に準じて行ってください。
1) 検体DNAをTE-バッファーに溶解させ、溶液の吸光度（260 nm）を測定する。その吸光度値から100μg/mlになるようTE-バッファーで希釈調製する。
（DNA濃度は50μg/mlのときの吸光度を 1.0 として算出。）
2) 検体DNA溶液100μlにARP溶液100μlを添加する。
3) 37 ℃、１時間反応させる。
4) 200μlのイソプロピルアルコールを添加し、−30℃で50分間冷却する。
（DNAの回収は汎用的なエタノール沈殿法でも可能です。）
5) 遠心分離しDNAを沈降させる（10,000xg, 15分間）。
6) 上層のイソプロピルアルコールを捨て、75 % エチルアルコール200μlを添加し、再び遠心分離しDNAを沈降させる（10,000xg, 15分間）。
7) 上層の75 % エチルアルコールを捨て、遠沈管のDNAを風乾する。（室温, 5分間）
8) TE-バッファーを1ml添加し再び溶解してDNA溶液とする。（約 10μg/ml）
9) このDNA溶液の吸光度（260 nm）を測定し、1)と同様にDNA濃度を算出する。
10）TE-バッファーにより、DNA 濃度が0.2μg/mlになるように希釈し、検体DNA溶液とする。
● dsDNAは、陰イオン性のため、タンパクの固相化等に用いられるポリスチレン表面のプレートにはほとんど吸着しません。DNAをプレートに固相化させる方法は多く紹介されていますが、このキットではアミノプレートに固相化させる方法を用いております。この方法は、比較的バックグラウンドが低く、再現性も高い方法です。
キットに含まれる標準ARP-DNAと希釈用ARP-DNAを下記の様に混合し、0〜5AP sites標準液を調製します。
| AP sutes / 10,000 nucleotides | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 標準ARP-DNA(μl) | 0 | 200 | 400 | 600 | 800 | 1000 |
| 稀釈用ARP-DNA(μl) | 1000 | 800 | 600 | 400 | 200 | 0 |
1) 同梱のアミノプレートを開封し、4-2でARP化した検体DNA溶液を１ウェルにつき、200μl添加する。また、比較用として別のウェルに4-3で調製した標準DNAを濃度の順に添加しておく。
2) 37℃で１時間インキュベートする。
3) PBSTでプレートを10 回洗浄する。
4) ブロッキング用BSA溶液を１ウェルにつき、300μl添加する。
5) 37℃で２時間インキュベートする。
6) PBSTでプレートを10 回洗浄する。
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注意）プレートの洗浄によって、バックグラウンドの吸光度が大きく変わってきますので、充分に洗浄液をきってください。以下の洗浄も同様に行ってください。 |
4-4で固相化したプレート上のビオチン化AP siteは、通常のビオチン検出法で発色させ検出することができます。ここではアビジン−ビオチン−PODコンプレックス（ABC試薬, Vector社製）でビオチンを認識し、そのペルオキシダーゼ（POD）活性によって基質（o-フェニレンジアミン（OPD）, SAT-blue）を発色させる方法を記載しております。なおSAT-blueは弊社で市販しているPOD基質のことを指します。
1) １ウェルにつき、200μl のABC試薬（使用法に記載されている濃度に希釈しておく）を添加する。
2) 37℃で１時間インキュベートし、ビオチンとABC試薬を反応させる。
3) PBSTで10回洗浄する。
4) POD発色基質溶液（OPD + H2O2またはSAT-blue溶液）を１ウェルにつき、160μl 添加する。
5) 30分間、37 ℃にて反応させる。
6) 4mol/l H2SO4を 40μl 加えて、反応を停止させる。
7) 490 nmにおける吸光度を測定する。
標準DNAの吸光度から検量線を作成し、AP site数を算出する。
バックグラウンドを補正した標準DNAの検量線を下図に示す。
標準DNAを調製した際の方法を以下に記載します。
1) 50mlのポリプロピレン製遠沈管※に市販の牛胸腺DNAを20mg秤量して20mlのタンパク変性用溶液を添加し、DNAが溶解するまで4℃で振とうする。DNAは繊維状であり、溶解しにくいので細かく割いて、緩やかに振とうしながら溶解する。
| ＊DNAはガラスに吸着し易いため、使用する容器の材質はポリプロピレンをお勧めします。 |
1) Sancar, A. and Sancar, G. B., Annu. Rev. Biochem., 57, 29-67（1988）.
2) Lindahl, T. and Nyberg, B., Biochemistry, 11, 3610-3618（1972）.
3) Liuzzi, M. and Talpaert-Borle, M., J. Biol. Chem., 260, 5252-5258（1985）.
4) Weinfeld, M., Liuzzi, M. and Paterson, M. C., Biochemistry, 29, 1737-1743（1990）.
5) Chen, B. X., Kubo, K., Ide, H., Erlanger, B. F., Wallace, S. S. and Kow, Y. W., Mutat. Res., 273, 253-261（1992）.
発色にはアビジン-POD試薬、POD検出用発色試薬が別途必要になります。これらの試薬は、メーカーの違いや保存期間によってそれぞれ活性が違ってきます。つきましては、別のウェルで活性を確認していただく必要がございます。