Ｑ＆Ａ

新規タンパク質定量キット

-Proteostain-
Protein Quantification Kit - Rapid
-Proteostain-
Protein Quantification Kit - Wide Range

Q1. それぞれのキットの測定原理を教えて下さい。

A1. RapidはBradford法を採用しています。Coomassie Brilliant Blue G (Fig.1)をタンパク検出用試薬として用いており、高感度で反応が速いという特長を持っています。

Fig.1

Fig.1 Coomassie Brilliant Blue G

Coomassie Brilliant Blue Gはタンパク質に作用し、酸性条件で青色に呈色します（ λ =595 nm付近）(Fig.2)。しかも呈色反応は1分以内に終了し、生じた色素は30分以上安定です。この方法を使うことにより数分程度でタンパク質定量を行うことができます。

Fig.2

Fig.2 Coomassie Brilliant Blue Gの吸収スペクトル
a) タンパク質無し
b) タンパク質(BSA):500 μg/ml

一方Wide Rangeはtetrazolium salt であるWST-8を用いた方法になります。塩基性条件でWST-8はタンパク質により容易に還元され、青色のformazan dyeを生成します。

Fig.3

Fig.3 WST-8とそのformazan dyeの構造式

Fig.4

Fig.4 WST-8の吸収スペクトル
a) タンパク質無し
b) タンパク質(BSA):200 μg/ml

Q2. 定量できるタンパク質の濃度範囲はどのくらいですか？

A2. BSA換算でRapidはStandard 法で10 μg/ml ～ 2,000 μg/ml、Micro法で0.1 μg/ml ～ 50 μg/mlです。Wide Rangeは50 μg/ml ～ 5,000 μg/mlです。

Q3. キット以外に必要な器具として何を準備すればいいのですか？

A3. マイクロプレートリーダー、96 穴マイクロプレート、20 μl, 200 μl マイクロピペッター（可変式）、1.5 ml遠心チューブになります。マイクロプレートリーダーは、Rapidの場合600 nmのフィルターが、Wide Rangeの場合650 nmのフィルターが必要になります。

Q4. 保存はどのようにすればいいでしょうか？

A4. Rapidの場合、冷蔵（0～5℃）で保存して下さい。CBB solutionは0～5℃で12ヶ月、室温では6ヶ月安定です。0～5℃の保存においてバックグラウンドの上昇はありません。
Wide Rangeの場合、冷蔵（0～5℃）の遮光条件で保存して下さい。WST-8 solutionは0～5℃で12ヶ月、室温で3ヶ月安定です。またBuffer solutionは室温で18ヶ月安定です。しかし、炭酸ガスを吸収してpHが下がる恐れがあるので、使用後はしっかりとキャップを締めて下さい。BSA solutionは0～5℃で12ヶ月安定です。

Q5. タンパク種による感度の差はどの程度ですか？

A5. 下記Table 1をご参照ください。正確な値を得るためには同じタンパク種を用いて検量線を作成して下さい。

Table 1 タンパク種による感度の変動

Protein Protein vs. BSA^a)

Rapid Wide Range

BSA 1.00 1.00

chymotrypsinogen A 0.67 0.75

transferrin 1.02 0.97

human lgG 0.96 0.37

a) 値は検量線の傾きの比を示す。
（タンパク種の傾き/BSAでの傾き）

Q6. 濃いタンパク質の濃度を測定する場合に注意する点を教えて下さい。

A6. Rapidの場合、BSA換算で2,000 μg/mlまでは測定できます。それ以上になるとCBB solutionとの混合時に沈殿を起こす事があります。その場合には予めサンプルを希釈して用いて下さい。Wide Rangeは5,000 μg/mlまで測定可能なので、濃いタンパク質濃度を測定する場合には、Wide Rangeがお勧めです。

Q7. 測定に阻害を与える物質とその濃度について教えて下さい。

A7. 下記Table 2をご参照ください。阻害物質が高濃度に含まれる場合は用いる前に除去操作を施して下さい。

Table 2 測定に影響を及ぼさない阻害物質の最大濃度*

Chemical Concentration

Rapid Wide Range

Detergent

Brij 35
Brij 56
Brij 58
Trton X-100
Trton X-114
Tween 20
Tween 80
SDS
CHAPS
CHAPSO
MEGA 10
Octyle-β-D-glucoside
NP-40

Organic solvent

ethanol
isopropanol
DMSO

Chelating agent

EDTA
DTPA

Salt

sodium chloride
potassium chloride
sodium acetate
sodium bicarbonate

Buffer

citrate pH 5.0
MES pH 6.1
Tris pH 7.4
PBS
HEPES pH 7.5
CHES pH 9.0

Reducing agent

glucose
glutathione
ascorbic acid
dithiothreitol
2-mercaptoethanol

0.13%
0.03%
0.01%
0.13%
0.13%
0.25%
0.10%
0.10%
4%
4%
4%
0.50%
0.75%

10%
10%
10%

0.4mol/l
0.4mol/l

2 mol/l
2 mol/l
0.4 mol/l
0.1 mol/l

0.125 mol/l
0.125 mol/l
0.0625 mol/l
Undiluted
0.125 mol/l
0.125 mol/l

2 mol/l
0.04 mol/l
0.4 mol/l
1 mol/l
1 mol/l

2%
1%
1%
1%
1%
0.50%
0.30%
1%
4%
2%
0.50%
0.50%
7.5%

10%
10%
10%

2.5 mmol/l
0.625 mmol/l

0.5 mol/l
1 mol/l
0.2 mol/l
6.25 mmol/l

0.6 mol/l
0.125 mmol/l
2.5 mmol/l
Undiluted
12.5 mmol/l
12.5 mmol/l

＊無添加のBSAによる検量線との誤差が5%以内の濃度を示す。
＊両キットとも、Urea 50％含有まで影響はない。

Q8. 吸光光度計を用いて測定することもできますか？

A8. Rapid、Wide Rangeそれぞれマイクロプレートを使わず、吸光光度計を用いてセル法で測定することが可能です。Rapidの場合、500回用で最大80サンプル、2,500回用で400回測定できます。また、Wide Rangeの場合は500回用で最大40サンプル、2,500回用で200サンプル測定可能です。セル法での測定方法は、取扱説明書を参照して下さい。

Q9. サンプル中の界面活性剤濃度が、許容範囲よりも高い場合、どうしたらよいですか。

A9. Table 2に記載のそれぞれの界面活性剤について、濃度が許容範囲以下になるようサンプルを希釈するか、市販の界面活性剤除去キットを使用して除去してください。

Q10. このアッセイで得られたタンパク量はBSA換算値ですが、真のタンパク量を知るにはどうしたらよいでしょうか。

A10. BSAの代わりに、目的のタンパクを用いて検量線を作成し、その検量線からタンパク量を求めてください。

品名	容量	価格（￥）	メーカーコード

-Proteostain- Protein Quantification Kit - Rapid
	500 tests 2,500 tests	4,000 11,000	PQ01 PQ01
-Proteostain- Protein Quantification Kit - Wide Range
	500 tests 2,500 tests	4,000 11,000	PQ02 PQ02