ケミストからみたポストゲノム4

～タンパク質相互作用の解析法（1）～

九州大学工学研究院応用化学部門

片　山　佳　樹

1．はじめに

　ゲノム配列が明らかになり、ORFが推定され、遺伝子配列が同定されると、多くの未知遺伝子が発見されてくる。さらに、それらの中から、DNAアレイを用いた遺伝子の発現差解析により疾患などに関連した遺伝子が同定されてくると、それらを用いた創薬などの産業利用が期待される。しかし、実際にはそれら遺伝子の機能が分からなければ、産業利用は困難である。遺伝子の機能とは、それから発現してくるタンパク質の機能であるが、これを調べることは容易ではない。細胞内でのタンパク質の種類は10万種ともいわれるが、これらのタンパク質が様々に相互作用しあい、極めて複雑なネットワークを形成しているからである。ゲノム研究の究極の目的も、このタンパク間ネットワークの解明にあるといえる。残念ながらこれを解決する手法はまだ存在しない。しかし、これを解決していく一つの糸口は、2つのタンパク間あるいはタンパクとリガンド、DNA等の相互作用を網羅的に解析していくことである。
　タンパク間の相互作用を評価する手法としては、これまで免疫共沈降法^1）や光アフィニティーラベル^2）、架橋剤を用いてタンパク複合体を架橋後クロマトグラフィーで単離するなどの手法があったが、少量の試料では困難であった。近年、これらをハイスループットで網羅的に行える手法が様々報告されている。それらは、大きく分けて以下のようなものである。

1）免疫共沈法などの概念の改良法

2）プロテインアレイを用いる手法

3）in vivoで行える手法

4）蛍光エネルギー移動を利用する手法

5）その他

これらの手法には、一長一短があるが、最近、3）に属する手法が注目され、多くの手法が開発されている。これらの手法は、Yeast Two Hybrid System(Y2H)に代表される手法であり、対象とする 2つのタンパク間の相互作用が、あるタンパクの機能の再構成（回復）を促すことを利用し、相互作用の有無を判定する。今回は、このカテゴリーに属する手法についてご紹介する。

2．Yeast Two Hybrid System(Y2H)

　Y2Hは、FieldsとSongにより初めて報告された手法である^3,4）。真核細胞において、遺伝子の転写を制御する転写制御因子は、分子内に標的遺伝子配列に結合するDNA結合ドメイン(DBD)と転写を活性化するドメイン(AD)が機能的に独立に存在する。これを利用したのがY2Hであり、酵母の転写活性化因子であるGAL4の DBDとADをそれぞれ、調べたい2種類のタンパク（PreyとBait）と結合したキメラタンパクを発現する遺伝子を設計し、酵母で発現する。もし、発現した2種類のタンパクが相互作用すれば、各々に結合したDBDとADが再び近傍に配置され、GAL4の転写活性化能が回復する。酵母内に、β-ガラクトシダーゼ等の遺伝子を GAL4プロモーター下流に組み込んだレポーター遺伝子を導入しておくと、回復したGAL4活性により、レポーター遺伝子が発現し、その酵素活性を発色基質などで計測すると、タンパク間の相互作用の有無が判定できる（Fig.1a)）。
　この手法は、感度が高く、タンパクが精製あるいは同定できていなくとも、遺伝子さえ手に入れば評価可能であり、ゲノム研究向きである。最近、これを用いたハイスループット手法により、 6000種の酵母遺伝子ライブラリを用いて相互作用のマップを作成するなど^5）、千種を超えるタンパク間の相互作用を網羅的に解析する試みがなされている^6）。ただし、Y2Hには欠点もある。例えば、相互作用は細胞核内で、しかも転写装置の近傍で起こらねばならず、細胞質や特に細胞膜のタンパクには不向きである。タンパク自身が転写活性を持つ場合も正確な評価ができない。また、哺乳類のタンパクを酵母内でアッセイすると、正確なタンパクの折り畳みができなかったり、翻訳後修飾がなされなかったり、他の会合に必要な因子が存在しないなどの理由で、実際には相互作用するにもかかわらず、酵母内では相互作用しない場合がある。調べたいタンパクがホモダイマーを形成する場合も、ヘテロダイマーに競合して、相互作用が同定されない可能性がある（Fig.1b)）^7）。加えて、本手法は感度が高い反面、擬陽性が極めて出易く、実際には相互作用の判定はかなり困難である。

3．Y2Hの欠点を解決する種々の手法

3-1：酵母以外でのTwo Hybrid System

　前述したように、酵母内で哺乳類タンパクを発現した場合、実際の相互作用が再現できない場合がある。また、そのタンパクが酵母にとって毒性を有する場合もある。したがって、哺乳類由来のタンパクを調べる場合は、Two Hybrid Systemは、哺乳類細胞で行うことが理想的である。しかしながら、一般的には哺乳類細胞への遺伝子の導入効率は、酵母に比して低く、手間がかかる。遺伝子が導入された細胞を選別する場合、成長促進遺伝子や細胞表面抗原を用いると、より強い相互作用の組み合わせばかりが同定されてきたりする^8,9）。Shiodaらは、EBウイルス核抗原(EBNA) を発現したサルの腎臓上皮細胞株を用い、レポーター遺伝子として蛍光タンパクであるGFPを染色体内に組み込むことで安定化した系を用いている^10）。この細胞では、EBNA存在下で遺伝子複製開始配列(OriP配列)を有するプラスミドは、比較的低コピーで染色体外に安定に保たれ、転写できる。これを利用し、このプラスミドにPrey－AD融合タンパクを組み込み、哺乳類での発現効率を保障している（Fig.1c)）。彼らはこの系の有用性を、BaitとしてSmad4、Preyとしてメラノサイト特異的転写活性化因子 (MSG1)を用いて検討している。Smad4とMSG1は、TGF-β依存性に相互作用するが、酵母中では相互作用しないためY2Hでは陽性とならない。Smad4をGAL4DBDと融合した遺伝子と、MSG1をコードした遺伝子を共にトランスフェクトすると、 TGF-b依存性に、GFPの発現が認められている。

　これとは別に、Ras-GEF（GTP交換因子）であるhSosが細胞膜にリクルートされて活性化することを利用したSRSシステムも報告されている(Fig.1d)) ^11-13）。すなわち、BaitタンパクをSosと結合しておき、パートナー(Prey)をv-Srcミリストイル化などの膜局在シグナルと結合しておくと、PreyとBaitが相互作用する場合にSosが膜にリクルートされて活性化する。このシステムを温度感受性Cdc25株（Cdcは、酵母のRas-GEF）に用いると、対象タンパクが相互作用する場合に限り、Cdc25が失活する温度で、哺乳類hSosが活性化して生存することでモニターできる。Ras- GEF欠失哺乳類細胞などを用いれば、このシステムは哺乳類細胞でも用いることができる。ただし、Sosは大きいタンパクであるため、結合する調べたいタンパクが小さい場合に制限がある。また、 Baitの30％がSosと結合するとPreyが無くとも陽性を与えるなどの欠点がある。これを解決するため、より小さいタンパクである哺乳類Rasを用いるシステム(RRS)も報告されている^14,15）。この場合、Rasの膜局在化に必要なファルネシル化部位を除いた物を用い、これにBaitを結合した遺伝子を、前述のSosの代わりに導入する。Ras活性化の膜局在要求性は、Sosよりずっと厳密であり、擬陽性の確率は大きく低減できる。

　哺乳類細胞ではなく、バクテリア（原核細胞）でTwo Hybrid Systemを行うと、別の意味でメリットがある。バクテリアは、増殖速度が大きく、遺伝子導入効率も高い。また、多くの分子生物学的手法は、バクテリアで最適化されている。Karimovaらは、大腸菌のカルモデュリン依存性アデニル酸シクラーゼを1~224番目までのアミノ酸配列断片(T25)と225~399番目までのアミノ酸配列断片(T18)に分け、これにそれぞれPreyとBaitを融合し、それらが相互作用するとき、アデニル酸シクラーゼ活性が回復するようにした^{16, 17）}。これによりサイクリックAMPが合成されてくると、CAP(サイクリックAMP結合タンパク)依存性プロモーター支配下のレポーター遺伝子（β―ガラクトシダーゼ）が発現する (Fig.1e))。これをp－ニトロフェニルリン酸などの発色基質で検出する。これは、Y2Hの変法というよりは、むしろ次項で述べるタンパク再構成アッセイ（Protein complementation assay）であるが、Y2Hのバクテリア版として評価されている。レポーター遺伝子の下流に抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおくと、簡単にセレクションできる。また、タンパク間相互作用がY2Hの様に核内で起きる必要がないため、細胞内で起きる相互作用にも用いることができる。また、サイクリックAMPを仲介することで、シグナルが増幅されるメリットも考えられる。真核細胞のタンパクに可能と報告されているが、もちろん翻訳後修飾などの問題で、ある程度の制限はあると考えられる。

3-2：タンパク再構成アッセイ
（Protein ComplementationAssay, PCA）

　これは、酵素などを2つの断片に分解し、各々をPreyとBaitに融合して、これらが相互作用した場合、元のタンパクが再構成され、活性が回復することを利用して相互作用を同定するものである。Y2Hに比べ、ホスト特異的なプロセスや酵素が必要なく、利用できる細胞のタイプに制限が少ない。またタンパク間相互作用が、核内で起こる必要がない。さらに、タンパクの再構成を見るので、PreyとBaitに結合する断片の方向が重要で、これを利用すれば、調べたタンパク間相互作用の方向性も評価できるなどの利点がある。

3-2-1:PreyとBaitの相互作用で直接タンパクを再構成するタイプ（Fig.2a)）

18）やβ―ガラクトシダーゼ(β-Gal) ^19）を用いる例がある。

　DHFRを用いる例では、107番目のアミノ酸で切断した2つの断片F[1,2]とF[3]に分けて用いる。これに結合するPreyとBait としては、2量化するロイシンジッパーや、p21RasとRafのRas 結合ドメイン、FK506結合タンパク(FKBP)と酵母ラパマイシン標的タンパク(TOR2)のラパマイシン依存性結合、Epoレセプタータンパクなどが報告されている^20）。検出としては、DHFR欠損株での細胞の生存（タンパクが相互作用してDHFRが再構成されないと細胞は死滅）やフルオレセイン標識メトトレキセート(fMTX) のDHFRへの結合を利用した蛍光法が用いられる^20）。細胞の生存で見る場合、バクテリアでアッセイすれば、DHFRを欠損させなくても、これを阻害するトリメトロプリムで処理するとよい。哺乳類のDHFRは、この薬剤に対し1200分の1の親和力しかないため、影響を受けずにアッセイできる。またfMTXを用いる場合、 THFRに結合しない場合、細胞から迅速に排除され、また、結合したものは蛍光量子収率が4.5倍向上するので、感度良くDHFRの再構成がモニターできる。この手法の利点は、蛍光強度から結合したMTXを定量できるので、タンパク間相互作用のK_d 値や、それに影響する薬剤の能力を定量的に評価できる点である。

　β-Galを用いる手法では、11~41番目のアミノ酸を欠損させた Δαと始めの788アミノ酸部分であるΔωの2つの断片を用いる。この2つの断片自身の会合能力は低く、各々に結合したPreyと Baitの相互作用に依存している。FKBP12とラパマイシン依存性にFKBPと結合するFRAPを用いた例がある^19）。

　これらの手法は、対象とするタンパクや用いる細胞に制限が少なく、相互作用を直接評価できるのが利点だが、擬陽性が多いとも言われている。

3-2-2：タンパクの再構成と共にレポータータンパクの切断を介在させる方法

　単純に、対象タンパクの相互作用が、それらに結合するレポータータンパクの再構成を促すのではなく、相互作用に伴いレポータータンパクが切断されてくるタイプもある。まず、Johnssonらは、ユビキチンを用いた系を報告している(Fig.2b)) ^21）。ユビキチンは76アミノ酸からなる小さなタンパクで、プロテアソームを介する不要タンパクの分解に関係する。真核細胞では、ユビキチンがタンパクに結合すると、ユビキチン結合タンパク(UBP)により、迅速にユビキチン－タンパク結合部位で切断される活性がある。ただし、このためにはユビキチンが正確にフォールディングされている必要がある^22）。そこで、ユビキチンをN末端1~37残基 (Nub)とC末端36~76残基(Cub)に分割し、NubのC末端とNub のN末端にそれぞれ対象とするタンパクをリンカー介して結合し、さらにCubのC末端にはDHFRなどのレポータータンパクを結合する。もし、対象タンパクが相互作用すると、互いに接近するユビキチンが正しい折り畳みを起こし、UBPにより結合しているレポータータンパクが切断される。この切断を電気泳動などで確認する。この手法では、Cubに結合しておくレポータータンパクの種類をいくつか用意しておくと、これにそれぞれ異なるタンパクを結合させることにより、どのタンパクがどのくらい切断されてくるかで、Nubに結合したタンパクとの相互作用の強さを比較することもできる。ただし、切断前後でレポータータンパクの機能が変化するわけではないので、切断は電気泳動などでアッセイせねばならず煩雑さが伴う。

　これに対し、Umezawaらは、タンパクスプライシングを利用した手法を報告している^{23, 24）}。これは酵母の発生期の翻訳産物から内部のタンパク(Intein)が正確に切り出され、その両側（外側の）2つのタンパク断片（Extein）がライゲーションされる現象を利用したものである。すなわち、このInteinを2つに分割し、それぞれにExteinを結合し、他方の末端にPreyとBaitを結合すると、それらが相互作用した場合、2つのIntein由来の断片が接近し、元の形にフォールディングされることにより、スプライシング活性が回復し、Exteinがライゲートされ切り出される。この Exteinにレポータータンパクの断片を用いると、これによりレポータータンパクが再構成され、その回復した酵素活性などの機能によりタンパク間相互作用が評価できる(Fig.2(c))。彼らはまず、120kDaのVMA1翻訳産物のInteinである50kDaエンドヌクレアーゼ(VDE)を128番目のアミノ酸で2つの断片に分けたものに、蛍光タンパクであるEGFPを2つに分割した断片をExtein として結合し、反対側に調べたいタンパクをそれぞれ結合した^23）。モデル系としてカルモデュリンとそれに結合するM13ペプチドを結合したところ、大腸菌内でのその相互作用に基づきEGFP由来の蛍光の増大が見られる。この手法は、酵素基質などが要らないなどの利点があるが、哺乳類細胞では感度が足りなかった。そこで、Inteinとして酵母のDnaEタンパクを用い、レポーターとしてルシフェラーゼを用いて同様のシステムを構成することで、この問題を解決している^24）。モデル系として、インスリンレセプター基質1(IRS-1)とそのターゲットであるPI-3キナーゼのSH2ドメインを用い、そのインスリン依存性の結合をCHO-HIR細胞内で評価し、その有用性を報告している。ただし、実際にインスリン刺激によりIRS-1がリン酸化されていると考えられる時間より、本アッセイでIRS-1とSH2ドメインの相互作用が確認できるには長い時間が必要で、また、他のインスリン非依存性リン酸化によるバックグラウンド増加などいくつかの改善されるべき問題もあるが、薬物やアゴニストのスクリーニングなどにも使える可能性があり、興味深い。

4．タンパク間相互作用以外への応用

　これまでの手法は、いずれもPreyとBaitの相互作用が、別のタンパクの何らかの機能の変化を引き起こすものであるが、これを応用すると、タンパク間の相互作用以外のアッセイにも適用できる。

4-1：DNA－タンパク相互作用評価法（One Hybrid System） (Fig.3a))

　標的DNA配列に結合するタンパクを、ライブラリーから探索したり、逆にあるタンパクが結合するDNA配列を探したりする場合、対象タンパクに転写活性化ドメイン(AD)を結合し、レポーター遺伝子の上流に調べたいDNA配列を結合しておくと、これが対象タンパクと結合した場合のみ、レポーター遺伝子の発現が起こり、容易にアッセイできる^25,
26）。Wangらは、このシステムを用い、嗅覚細胞特異的な遺伝子の発現スイッチに関係する転写活性化因子Olf-1を発見している^26）。また、Paboらは、バクテリアでDNA結合性ZnフィンガータンパクのターゲットDNA結合配列をこのシステムを利用してデザインしている^25）

4-2：タンパクー小分子相互作用評価法（Three Hybrid System）（Fig.3b)）

　前述のβ-GalやDHFR再構成を利用するPAC法では、ラパマイシン依存性のFKBPとFRAPの結合が用いられたし、タンパクスプライシングを用いる方法では、インスリン依存性のIRS-1と SH2ドメインの結合がアッセイされている。これらは見方を変えれば、ラパマイシンやインスリン類似物質やアゴニストの標的タンパク結合のアッセイにも用いることができる。この考え方をさらに発展させたのが、Three Hybrid Systemである^27-32）。このシステムでは、レポーター遺伝子の上流の配列に結合するDNA結合ドメイン(DBD)とリガンドAのレセプターを結合したHook、リガンドBのレセプターを転写活性化ドメイン(AD)と結合した Fish、リガンドAとBを化学的に結合した人工リガンド(Bait)を用いる。HookとFishをコードする遺伝子を細胞に導入し、人工リガンドを細胞内に投与すると、リガンドとそれぞれのレセプターの結合により、DBDとADが近傍に固定され、レポーター遺伝子の発現が起こる。ここで、例えばリガンドAとHook内のレセプターは既知の強力に結合するものを用いると、人工リガンドのBに相当する部分をコンビケムなどで種々合成して、Fish内のレセプターBに結合するリガンド分子を探索できる。逆に、リガンドAにリンクしたリガンドBに結合するタンパクをライブラリーからスクリーニングすることも可能である。このシステムは、

初めにFK506ダイマーをリガンドとして報告された^27）が、LicitraとLiuは、Hook側のレセプターAにグルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメイン、Fish側のレセプターBにFK506 結合タンパク(FKBP12)を用い、人工リガンドとしてデキサメタゾンとFK506を化学的に結合した分子を合成して、この系の有用性を示し、既知薬物の細胞内ターゲットの同定に使えると主張している^28）。実際、Jurkat T細胞ライブラリーでFK506に結合するタンパクの同定を行い、ヒトFKBP12の2種類のバリアントを 3週間で見出している。既存の手法では、1年以上かかるという。ただし、元からあるFKBPの競合により、会合能力の強いものしか見つからない問題もある。また、人工リガンドは、この例のように疎水性のものはよいが、親水性のリガンドでは酵母の細胞内に透過しないという問題もある。それでも、同様の系を用いて FK506合成アナログの性能評価やデキサメタゾンとメトトレキセートを結合したリガンドを用いたシステム、ラパマイシンと FK506結合リガンドを用いて、Fishに結合したラパマイシン会合タンパクに種々の変異を導入してのラパマイシンに高選択的なミュータントのスクリーニングの試みなどが報告されている^29）。

4-3：RNA-タンパク相互作用の評価法(Three Hybrid System)(Fig.3c))

　RNA-タンパク間相互作用の評価は、RNA-タンパク融合体が in vivoで合成できないので、Y2Hの直接の応用は難しいが、 Three Hybrid Systemを利用することで解決できる^33）。すなわち、前述の系で人工リガンドの部分にRNA分子を用いる。その際、 RNAの半分は、既知タンパクに結合する配列を用い、もう半分に調べたい配列を結合する。すると、その部分がFishのタンパクと結合した場合にだけ、レポーター遺伝子の発現が見られる。例えばこの系を利用して、線虫の3ﾕ-fem-3遺伝子の非翻訳領域に結合して精子/卵子のスイッチを仲介するタンパクの探索などが行われている^34）。

5．おわりに

　以上、遺伝子を用いて細胞内(in vivo)でタンパク間やタンパク－リガンドなどの相互作用を評価できる手法について概説した。これらの手法は、いずれもタンパクが同定されなくても遺伝子さえ取得できれば評価に供することができ、迅速性、感度、ハイスループット化などの点で、既存の手法よりも優れている。しかし、系によって、擬陽性の出易さ、利用できる細胞のタイプ、利用できるタンパクのタイプなどに制限があるなど、それぞれ長所と短所がある。にもかかわらず、これらの使い分けをして、ハイスループットの網羅的解析系にもっていけば、今後、タンパク機能の解明、未知タンパクや未知リガンド、新薬や遺伝子配列の探索に大きな力を発揮するものと期待できる。次回は、これらの手法以外のタンパク相互作用の評価法についてご紹介する。

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