九州大学工学研究院応用化学部門
片 山 佳 樹
ゲノム情報を利用していくためには、遺伝子を取得するだけで は不十分である。遺伝子の機能、言い換えれば遺伝子から発現す るタンパクの機能を知ることが不可欠である。ゲノムワイドな視 点からタンパク機能を研究する分野をプロテオミクスというが、 これがポストゲノム研究の中心課題である。プロテオミクスは、タ ンパクの量的変化、機能的変化、構造的変化、相互作用、さらに タンパク全体のネットワークの解析など、極めて広範囲なカテゴ リーを含む。しかし、遺伝子に比べ、タンパクは極めて複雑な性 質を有しており、現状の技術では、アプローチが困難であるのが 現状である。ここではまず、プロテオミクス研究の重要なツール として期待されるプロテインアレイ及びペプチドアレイについて 概説し、その内の1つであるタンパク検出用のアレイについてご 紹介する。その後、何回かに分けて各タイプのアレイに関しても 解説してみたい。
プロテインアレイは、何を目的とするかで、大きく分けて2つ のタイプに分類できる。1つは、これまでDNAアレイを用いて行 われてきた遺伝子発現差解析の流れを汲むものである。すなわち、 これまでmRNAの量的変化で評価してきたものを、その最終生成 物であるタンパクの量的変化で直接見ようとするものである。一 方、もう一つのアレイは、調べたいタンパクや薬物などが結合す る標的タンパクを探そうとするものである。言い換えれば、タン パク間、タンパク−小分子、タンパク−核酸などの相互作用を直 接評価することを目的とするアレイである。Kodadekは、前者を Protein-detection array、後者をProtein-function array、MacBeathは、前者をQuantitative proteomics、後者をFunctional proteomicsと呼んでいる1, 2)。両者は、全く異なるものであり、要求される条件やアプローチ法、現状における問題点も大 きく異なるため、別個に考える必要がある。これに対し、ペプチ ドアレイは、よりコンビナトリアルケミストリーの側面を有し、酵 素の基質探しやインヒビターの探索などに用いられる 3)。
DNAアレイの開発は、疾患などにより遺伝子の発現状況が どのように変化するかをゲノムワイドに調べることを初めて 可能にした。これにより、種々の疾患に関連すると思われる多くの遺伝子が 発見されてきた。この手法は、遺伝子から転写されるmRNAのレ ベルの変化を正常細胞の状況と直接比較するものである。しかしな がら、mRNAの量と、それから翻訳されるタンパクの量には密接 な相関が無く、ある場合には20倍以上も異なることが分かってき ている4)。さらに、タンパクは、リン酸化、糖化、アセチル化など の翻訳後修飾や限定分解により、機能の全く異なる状態に変化す る。この様な理由から、mRNAレベルでの発現状況のパターンか らは、間接的な情報しか得られない。従って、より直接的な情報 を得るためには、どうしてもタンパク全体の発現状況（Proteome）を検討する必要がある 5)。この様な目的のために現在、もっともよく用いられる手法は、2次元電気泳動である 6)。この手法は、通常のゲル電気泳動と等電点電気泳動をそれぞれ90度 異なる方向に行うことによって、細胞内に発現した全タンパクを バイアス無しに全て分離、検出しようとするものである。分離さ れたタンパクのスポットは、銀染色などで可視化し、同定はマス スペクトル(TOF-MS等)で行う。ところが、銀染色では感度に問 題があることに加え、タンパクの量は、大きいものでは10 6倍も異なるため、量的に少ないタンパクは検出が困難である 7)。しかしながら、重要なタンパクには量が少ないものが多い。さらに、ハ イスループット化が困難であることや、マススペクトルは定量性 の問題があることも欠点である。
一方、全タンパクの発現量変化を見るのではなく、特定の標的 タンパクの変化を追跡するのであれば、検出はもっと楽になる。 Paweletzらは、laser captured microdissectionにより取得したガン病変部位の溶解液(lysate：すなわち全タンパクの混合物) を、ガラススライドに保持したニトロセルロース膜に3 nl (250-300 mm)づつスポットし、対象タンパクに対する抗体を用いて検 出した8)。検出はELISA法を利用し、蛍光標識抗体、あるいはHRP 標識抗体を用いた化学発光法により、リン酸化型ErkやAkt、切断 型Caspase-7やPARPの量的変化を計測している。その結果、ガ ンの進行に伴い、リン酸化Erkは減少し、リン酸化Aktは増加す ることを見出した。しかしながら、この様な手法では、感度が低 い(1 ng/ml)ことと、一度に多くの対象を計測できないのが難点で ある。これに対し、もし基板上に、予め各タンパクを認識して結 合するサイトを設けておけば、それぞれの場所にタンパクを捕捉 し、最適の検出法で必要なタンパク群の量的変化を直接評価でき る。これを可能にするのが本プロテインアレイである。また、DNA アレイでは本質的に不可能な、タンパクの翻訳後修飾の変化を見 ることができるのが利点である。一方、本手法では扱えるのが既 知タンパクに限られるのが欠点である。
基板上の所定の位置に目的タンパクを捕捉するためには、それ らを特異的に認識して結合するリガンドが必要である。そのよう なリガンドとして最も可能性の高いものは抗体であろう。Silzelら は、4種のIgGモノクローナル抗体をポリスチレンフィルムにス ポットして同時分析を試みた9)。これが最初の例である。その後、 多くの例が報告されており、例えば、Schweitzerらは75種類の 抗サイトカイン抗体をアレイ化している10)。しかしながら、もし ゲノムワイドなタンパクの量的変化を追跡しようとするなら10万 〜100万種の抗体が必要であり、この様に多種類の抗体を如何に 取得するかが問題である。ある程度網羅的解析をしようとするな ら、少なくとも1000種の抗体は欲しいところである。しかしなが ら、従来の動物やハイブリドーマを用いる手法では,手間と時間が かかりすぎ、現実的ではない。ファージディスプレイを用いる単 鎖抗体のスクリーニング11)は、将来的に可能性のある手段である が、如何に結合力と特異性の高い抗体をハイスループットでスク リーニングできるかが今後の課題である。
抗体以外のリガンドとしては、アプタマーがある 12-14)。アプタマーは、核酸やタンパクの一部の配列をランダムに変化させて、特 定の分子に結合するものをセレクションすることで得られる。抗 体よりもセレクションが楽で効率がよい。特にDNAやRNAアプ タマーの場合は、PCRと結合アッセイを組み合わせることで、高 速でのセレクションが可能である12, 13)が、一方で、それ自身が負荷電を有しているので、タンパクの表面荷電の影響が大きい。タ ンパクアプタマーとしては、チオレドキシンを基本とするものが よく知られている。チオレドキシンは、小さく安定であることに 加え、ループ部分に配列を種々変化させても全体の構造に影響を 及ぼさない領域が存在し、この部分をアプタマーとして利用でき る14, 15)。アプタマーでは、如何に標的タンパクとの結合力の大き いものを取れるかが鍵である。SomaLogic社は、タンパクに結合 後、光照射でタンパクと共有結合するフォトアプタマ−の利用を 検討している16)。
コンビナトリアルケミストリーにより合成される小分子も、潜 在的にはタンパクのリガンドとなりえるが、1つの基本骨格で多種 類のタンパクに適応できる一般性を有するとは考えにくい。その ような中で、ペプチドリガンドは、タンパクとの結合力が高いも のが得られることが示されており（Kd=10 -9〜10-12mol/l）、リガンドとして使える可能性がある 17)。
いずれにしても、実用的な性能を有するリガンドを多種類確保 することは、今後の大きな課題である。
タンパク検出用のアレイは、基本的にはイムノアッセイのアナ ログである。従って、イムノアッセイの利点を有する反面、その 欠点も同時に有している。
DNAアレイで行われてきた発現差解析をタンパクレベルで行う には、コントロール細胞と対象細胞でのタンパク存在量を直接比 較しなければならない。この様な目的のための最も簡単なアプ ローチは、双方の細胞に存在する全タンパクを、それぞれ異なる 蛍光色素で標識するDual color approachである(Fig.2(a))18)。例えば、試料細胞の溶解液に存在するタンパクをCy5、コントロー ル細胞溶解液に存在するタンパクをCy3で標識して、両者を混合 して抗体アレイと反応すると、各タンパクの量的変化が蛍光によ り評価できるはずである。例えば、146種類の抗体を固定したア レイを用いて、放射線処理細胞と未処理細胞の溶解液をこのア プローチにより比較することで、ストレス応答や細胞周期調節に 関するタンパクの発現量変化が評価できた例がある 19)。しかし、タンパクは核酸と異なり、PCR法などに対応するサンプル増幅法が 無いため、検出シグナルの増幅を行わないこの様な手法では、検 出感度が低く（μg/mlよいものでもng/ml）、発現量が少ないタン パクの検出が困難である。検出シグナルを酵素反応により増幅す ると3ケタほど感度の向上が期待できる。タンパクを蛍光標識す る代わりにビオチン標識し、抗体アレイに結合後、酵素標識アビジ ンを用いてシグナルを増感する手法20)が報告されている(Fig.2(b)) が、Dual color approachが使えないため、直接比較ができない。リンパ球表面の分化抗原に対する抗体アレイにリンパ球そのもの を結合させて暗視野顕微鏡で検出するなどの方法(Fig.2(c)) 21)もあり、この場合には、細胞内を別の色で標識できるはずであるので 面白い。定量性の問題は改善できないが、今後、この手法で2色 が使える手法の開発が待たれる。しかしながら、タンパクへの直 接の標識は、タンパクそのものの性質を変化させる危険性を常に 包含している。例えば、リジン残基の側鎖アミノ酸にペプチド結 合などで分子を標識すると、タンパク質表面の正電荷を消去する ことになり、大きな摂動を与えてしまう。
タンパクを標識せずに検出できれば、上記の問題は解決できる。 ELISAにおけるサンドイッチ法は、まさにこの条件を満たしてい る(Fig.2(d))。サンドイッチ法は、標的タンパクを捕捉する固定化 抗体と別に、標的タンパクの別のエピトープを認識して結合する2次抗体を用いて検出する手法である。Huangらはメンブレンに抗 サイトカイン抗体をアレイ化し、サイトカインを捕捉後、ビオチ ン標識抗体を介してHRP標識アビジンやCy3標識ストレプトア ビジンを用いて、化学発光法や蛍光法で検出している 22)。また、Wieseらは96穴マイクロプレートのウェルに64種類の前立腺特 異的抗体をアレイ化し、ターゲットを捕捉後、2次抗体を作用さ せ、さらにHRP標識抗体を結合させて蛍光法によりインターロイ キンなどを計測している23)。同じくHRP標識抗体と化学発光法を 利用するサンドイッチアッセイを利用して、種々のメンブレンが 検討されており、Biotrans (ICN)、MagnaGraph(MSI)、HybondECL(Amersham)などが適しているとの報告がある 24)。最近、検出シグナル増幅法として酵素のほかに、SNP検出のとこ ろでご紹介したSniperアッセイと同じ、DNAのRolling circle amplification25)をサンドイッチイムノアッセイに適用した例もあ る10)。この手法は、将来的にDual color approachに適用できると面白い。サンドイッチ手法は、一般に2次抗体を用いることで 特異性も向上するのでよい方法であるが、各々の標的タンパクに 対し、互いに競合しない2種類の抗体が必要となるため、ゲノム ワイドでの適用はさらにハードルが高い。また、抗体は多くが糖 化されており、また認識部位の面積が大きいため、本来交互反応 性を有するため、DNAアレイのような高い定量性は期待できな い。まして、プロテインアレイでは非常に多くのELISAを同時に 同じ基板上で行うわけであるから、条件の最適化は解決すべき多 くの問題を含んでいる。
タンパク標識無しで標的タンパクを検出するには、ELISA法の 利用のほかに、マススペクトルや表面プラズモン共鳴(SPR)があ り、抗体を使わない検出法として興味深い。マススペクトル法は、 直接タンパク質の同定ができるため、有用なツールである。ただ し、定量性が無いのが最大の欠点である。質量分析では絶対的な 定量性を解決することはできないが、標準サンプルの値と比較す ることで解決できる。ただし、同一のタンパクは分子量が同じで あるので、前述のDual color approachの様に、両者を混合して計測することができない。これを解決したのがICAT法 26)に代表される同位体タグの利用である。例えば、通常のチオール反応性 のビオチン標識剤と、その一部の水素を重水素化したものを、そ れぞれのサンプルに標識して混合し、検出時に限定分解して質量 分析すれば、システインを含む部位の量的変化を比較定量できる。 この他にも、片方の細胞を15Nを含む培地で培養して両者の質量に 差を生じさせる手法もある27)。この様な同位体タグの利用はこの 他にも種々あり、単にタンパク量変化のみではなく、翻訳後修飾 の解析などにも利用されている。この辺りの質量分析法のプロテ オミクスへの利用に関しては、改めてご紹介する。SPR法は、金 基板上に固定化した抗体へのタンパクの結合を、標識無しに検出 する手法である28)。表面プラズモンは、金属表面の自由電子波の 量子化された準位である。もし、基板の裏側から光照射すると、プ ラズモン吸収の効率は角度依存性がある。この共鳴角は、表面に 結合した分子の質量に依存するから、これを利用して表面におけ る分子の結合が検出できる。SPR法は、標識無しで分子の結合を 定量できること、kineticsが計測できるなどの利点を有するが、 Dual color approachの様な、サンプル間の直接比較ができないこと、結合した分子の直接の同定はできないこと、金のプラズモ ン波長が長いため、高密度のアレイを作成できないなどの欠点が ある。Biacoreでは、将来的には1000サンプルのアレイを開発可 能であるとしており16)、将来的には質量分析法との組み合わせな ど、期待される手法の一つである。
DNAアレイは、配列さえ決まれば、アレイ上の一本鎖リガンド とターゲットは、ほぼ1：1で決まる。しかしながら、タンパクの 場合、本来種々のタンパクやその他の分子と相互作用する性質を 有している。分泌型のサイトカインなどではよいが、細胞内のタ ンパクでは、通常、多くのタンパクが多成分の複合体を形成して いる。もし、基板上の抗体に結合するエピトープ部分が、その他 のタンパクと複合体に使われている場合、抗体との競争になるた め、実際の量より過小評価されてしまう(Fig.3(a)) 29)。一方、もし抗体結合部位が、タンパク複合体形成部位と異なれば、基板上の 抗体に標的タンパクが結合した後、これにさらに他のタンパクが 会合するかも知れず、その場合、実際の量より過大評価されてし まう(Fig.3(b))。この様な問題は，サンドイッチ法を用いる場合， 2種の抗体が関わってくるから尚深刻である。質量分析では、会合 するタンパクを同定できるが、ELISA法やSPR法では、この問 題を本質的に解決できない恐れがある。
これに加え、抗体には本質的な交互反応性があるため、解析には 注意が必要である。また、抗体の標的結合力は、mmol/l〜nmol/l であり、もし、標的タンパクが量的にpmol/l以下であれば検出で きない危険性を伴う。
以上、タンパク検出用のプロテインアレイについて概説した。こ のタイプのアレイは、これまでDNAアレイで行われてきた発現差 解析をより正確に行うためのものである。2次元電気泳動などとは 異なり、目的に応じた標的群のみの量的変化を直接評価できるこ とと、何よりもDNAアレイでは絶対に不可能な翻訳後修飾の様な 機能変化を追跡できることが一番の利点である。しかしながら一 方で、タンパクは核酸に比べ機能を受け持つ分子であることから も分かるように、非常に扱いや解釈の複雑な分子である。従って、 プロテインアレイを単純にDNAアレイの延長という風に安易に捉 えて開発することはできない。そこにはご紹介したように、これ から解決しなければならない、しかも非常に困難なハードルが数 多く存在する。例えば、Zyomyx、Somalogic、HTS Biosystems、Phylos、Biacoreなどの各社がいずれも2001年末までにプロテ インアレイを上市させることを表明していたにもかかわらず、軒 並み製品化が遅れていることからも分かる様に、その開発が如何 に困難であるかが分かる。現在、プロテインアレイとして製品化 されているものは、CiphergenのSELDI-MS検出用の低密度型 フィルターアッセイ法くらいである30)。これは、理想的なタンパ ク検出用アレイとは言いがたいが、それでも2001年にその売り上 げは、1900万ドルとタンパクアレイを待望する市場が如何に大き いものであるかが分かる。潜在市場は、Bioinsightの見積もりで は、2006年に5億ドル、Biacoreの見積もりでは20億ドルとも いわれている。今後、リガンドの取得、検出法の改善などがなさ れ、実用的アレイが開発されれば、診断法を初め多くのDNAアレ イの市場は、プロテインアレイに取って代わられることが十分に 予想できる。次回は、目的タンパクや分子の結合標的タンパクを 探索するためのプロテインアレイについてご紹介する。
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