試作品

ペルオキシダーゼ標識用キット

Peroxidase Labeling Kit - NH₂

＜特長＞

・3時間以内にペルオキシダーゼ標識体が調製できる。

・高分子化合物（M.W.>50,000)から低分子化合物（M.W.<5,000) まで標識できる。

・Amine Reactive Peroxidaseと混ぜるだけで安定な共有結合を形成する。

・Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。

・付属の保存溶液でペルオキシダーゼ標識体の長期保存ができる。

　ペルオキシダーゼは、エンザイムイムノアッセイ（EIA)や組織染色などに利用される最も一般的な酵素で、多くのペルオキシダーゼ標識体が市販されていますが、研究の多様性から研究者が自らペルオキシダーゼ標識体を調製するケースが増えてきています。ペルオキシダーゼを標識する方法は、グルタルアルデヒド法や過ヨウ素酸法など、いくつか知られていますが、標識効率の低さや標識に時間を要するといった問題があります。また、透析やゲルろ過カラムを用いたバッファー交換は煩雑で時間がかかります。

　Peroxidase Labeling Kit - NH₂は、アミノ基を有する分子にペルオキシダーゼを標識するためのキットです。Amine Reactive Peroxidaseは、その構造内に活性エステル基を有しているため、アミノ基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。IgGのような分子量の大きい分子をサンプルに使用する場合、付属のFiltration Tubeを用いて簡単にサンプルの前処理を行うことができます。ペルオキシダーゼ活性や標識反応を阻害するような低分子化合物（アジ化ナトリウムやトリスなど）は、 Filtration Tubeを用いた前処理によって除去されるため、透析やゲルろ過などの処理を行う必要がありません。また、低分子化合物を本キットを用いて標識する場合、未反応の低分子化合物は付属のFiltration Tubeを用いた精製操作により除去されるため、高純度の標識体を得ることができます。

　本キットには標識に必要なすべての試薬と作製したペルオキシダーゼ標識体を保存するための溶液が含まれています。

＜キット内容＞3 サンプル標識用

Amine Reactive Peroxidase 100 μg x 3本

Buffer A 4 ml x 1本

Buffer B 4 ml x 1本

Storage Buffer 4 ml x 1本

Filtration Tube 3本

（キット内容は平成16年1月15日現在のもので、予告なく変更される場合があります）

Fig .1 Amine Reactive Peroxidaseの標識反応

＜操作方法＞

IgGへの標識

1. IgG 50～200 μgを含むサンプル溶液とBuffer A 100 μlを

　 Filtration Tubeに入れる。

2. ピペッティングにより軽く混合した後、遠心する（8000× g, 10分間）。

3. Buffer A 100 μlを加え、さらに遠心する（8000×g, 10分間）。

4. Buffer B 10 μlをAmine Reactive Peroxidaseに加え、ピペッティングにより溶解する。

5. この溶液をIgGが濃縮されているFiltration Tubeの膜上に加える。

6. ピペッティングにより膜全体をリンスした後、37℃で2時間放置する。

7. Buffer A 100 μlを加え、遠心する（8000×g, 10分間）。

8. Storage Buffer 200 μlを加え、ピペッティングし標識体を回収する。

9. 溶液を500 μl のマイクロチューブに移し、0～5℃で保存する。

低分子化合物への標識

1. 10 mmol/lの低分子化合物溶液 5 μlと45 μlのBuffer Bを混合する。

2. この溶液をAmine Reactive Peroxidaseに加え、37℃で1時間放置する。

3. Buffer B 100 μlを反応液に加え、溶液をすべてFiltration Tubeに移す。

4. 遠心する（8000×g, 10分間）。

5. ろ液を捨てた後、Buffer B 200 μlをFiltration Tubeに加え、遠心する（8000×g, 10分間）。

6. ステップ5を繰り返す。

7. Storage Buffer 200 μlを加え、ピペッティングし標識体を回収する。

8. 溶液を500 μlのマイクロチューブに移し、0～5℃で保存する。

Fig .2 本キットで合成したペルオキシダーゼ標識体の安定性
条件: 10 μg/mlペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Storage Buffer)を37℃で保存

Peroxidase Labeling Kit - SH

＜特長＞

・3時間以内にペルオキシダーゼ標識体が調製できる。

・高分子化合物（M.W.>50,000)から低分子化合物（M.W.<5,000) まで標識できる。

・Sulfhydryl Reactive Peroxidaseと混ぜるだけで安定な共有結合を形成する。

・付属の還元剤を用いることで遊離SH基を持たないタンパク質への標識も可能 *。

・Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。

・付属の保存溶液でペルオキシダーゼ標識体の長期保存ができる。

* S-S結合の切断によってタンパク質の活性が失われる場合があります。

　Peroxidase Labeling Kit - SHは、チオール基を有する分子にペルオキシダーゼを標識するためのキットです。Sulfhydryl Reactive Peroxidaseは、その構造内にマレイミド基を有しているため、チオール基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。標的タンパク質がチオール基を持っていない場合には、付属の還元剤を用いて遊離SH基を調製することが可能です（ただし、S-S結合の切断によってタンパク質の活性が失われる場合があります）。IgGヒンジ領域のチオール基を標識に利用すれば、抗体活性を損なわずにペルオキシダーゼを標識することができます。

　IgGのような分子量の大きい分子をサンプルに使用する場合、付属のFiltration Tubeを用いることで簡単にサンプルの前処理を行うことができます。ペルオキシダーゼ活性を阻害するような低分子化合物（アジ化ナトリウムなど）は、Filtration Tubeを用いた前処理によって除去されるため、透析やゲルろ過などの処理を行う必要がありません。また、低分子化合物を本キットを用いて標識する場合、未反応の低分子化合物は付属のFiltration Tubeを用いた精製操作により除去されるため、高純度の標識体を得ることができます。

　本キットには標識に必要なすべての試薬と作製したペルオキシダーゼ標識体を保存するための溶液が含まれています。

Fig .3 Reducing Agent によるIgGの還元反応

Fig .4 Sulfhydryl Reactive Peroxidaseの標識反応

＜キット内容＞3サンプル標識用

Sulfhydryl Reactive Peroxidase 100 μg x 3 本

Reducing Agent 400 μg x 3本

Buffer A 4 ml x 1本

Buffer B 4 ml x 1本

Reaction Buffer 4 ml x 1本

Storage Buffer 4 ml x 1本

Filtration Tube 3 本

（キット内容は平成16年1月15日現在のもので、予告なく変更される場合があります）

＜操作方法＞

●IgGへの標識

1. IgG 50～200 μgを含むサンプル溶液とBuffer A 100 μlをFiltration Tubeに入れる。

2. ピペッティングにより軽く混合した後、遠心する（8000× g, 10分間）。

3. Buffer A 150 μlをReducing Agentに加え、ボルテックスして溶解する。

4. この溶液100 μl をFiltration Tubeに加える。

5. ピペッティングにより膜上のIgGと混合した後、37℃で30分間放置する。

6. Buffer B 100 μlを加え、遠心する（8000×g, 10分間）。

7. ろ液を捨てた後、Buffer B 200 μlを加え、さらに遠心する（8000×g, 10分間）。

8. Reaction Buffer 50 μlをSulfhydryl Reactive Peroxidaseに加え、ピペッティングにより溶解する。

9. この溶液を還元IgGが濃縮されているFiltration Tubeの膜上に加える。

10. ピペッティングにより膜上の還元IgGと混合した後、37℃で 1時間放置する。

11. Buffer A 100 μlを加え、遠心する（8000×g, 10分間）。

12. Storage Buffer 200 μlを加え、ピペッティングし標識体を回収する。

13. 溶液を500 μlのマイクロチューブに移し、0～5℃で保存する。

●低分子化合物への標識

1. 10 mmol/lの低分子化合物溶液 5 μlと45 μlのReaction Bufferを混合する。

2. この溶液をSulfhydryl Reactive Peroxidaseに加え、37℃で1時間放置する。

3. 100 μlのReaction Bufferを反応液に加え、溶液をすべてFiltration Tubeに移す。