浜松医科大学光量子医学研究センター
櫻井 孝司
浜松医科大学・21世紀COEプログラム
「メディカルホトニクス」の活動として掲載
銃の先端部における突起部は、火縄銃が用いられていた時代に「目当て」と呼ばれていた。まさに照準（sight）の黎明期仕様であり、簡単で正確な照準法は現代まで模索され続けている。ライブセルイメージングにおいても同様であり、細胞における照準位置をどう決めるかが技術的に重要なポイントとなる。現在考えうる最良の解の1つは見たい対象を光学的にマーキングすることであろう。照準さえ定まれば、あとはピントを合わせて測定開始である。蛍光マーキング法の適用は測定のダイナミックレンジを拡げ、手法を容易にする。今回はライブセルにおける機能や動態を可視化するための蛍光マーキング法（live cell fluorescent marking, or live staining）を中心に、蛍光分子の選択からライブ画像取得までの基礎手順を紹介する。
2．1 蛍光発光と量子収率
蛍光とは蛍光分子に励起光を当てた後、励起された分子が元の 状態に戻るときに放たれる光である。蛍光強度は次のようなパラ メータに左右される。
１.励起光の波長とパワー
２.分子の吸収スペクトル
３.量子収率
励起光の波長は吸収スペクトルにおけるピーク値付近が通常は 用いられる。量子収率（quantum yield）1)は蛍光分子に吸収されたフォトン数と蛍光として発せられたフォトン数の比率である。 量子収率は熱発生や消光（quenching）1,2)により低下する。熱発生は蛍光色素の化学構造でほとんど決まっている。これに対して 消光は測定者の工夫で改善可能である。
消光は分子内過程による内部的要因と溶媒など外部的要因の両 方によるが、おもに後者となる。光と分子の反応過程において、熱、 赤外線、消光剤などに影響を受ける。消光剤には溶媒、酸素、色 素、重金属などがある。消光効果は、励起・蛍光エネルギーの消 失、無発光物質への化学変化、熱エネルギーへの変換などと物理 化学的に説明される。蛍光強度が最初から暗くなってしまう場合 は、消光が原因になっていることがあるので、外部環境の条件に ついて検討してほしい。
検出や定量を行いたい物質がある場合、専用のトレーサーまた はプローブが選択され、発光法・ラジオアイソトープ法・蛍光法 などにより検出される。蛍光法においては細胞にマーキングを 行ったあと、蛍光強度の測定をすることになる。系全体の光強度 を単に測る方法と比べて、直接見ることの利点をあげる。
１.分布（Fig.1a）
強度分布から対象の局在がわかる。時間経過を追うことで、分子移動や細胞内信号を見ることができる（Fig.2a）。測定対象の大きさが光学的な理論値以下（約0.2μm）であったとしても、その存在を一分子レベルで検出可能である3)。蛍光標識したあと、任意領域に光を集中させることで退色を促進させた後での回復を見る方法をFRAP（fluorescence recovery after photobleaching）4)とよぶ。FRAPにより細胞質における物質の流動や、細胞の区画といわれるフェンスの構築状態がわかる。
２.分子の相関（Fig.1b）
蛍光エネルギー移動（FRET, fluorescence resonance energy transfer）5)から分子間の距離や相関がわかる。分子の組み合わせにはfluoresceinとrhodamine6)、CFPとYFP（Fig.2b）7)がある。それぞれの蛍光分子を見たい対象に標識することで、リガンドと受容体8)、イオンと結合タンパク質9)、抗原と抗体10)などの距離から分子内の結合状態や分子間の親和性を定量化できる。
１.濃度や機能の定量化（Fig.1c）
蛍光のスペクトルや明るさの変化から分子や機能を定量できる。 受容体、細胞内イオン、膜へのマーキングより、電位などの測 定ができ細胞の活性化状態がわかる11, *1, 2)。ミトコンドリアや小胞分泌追跡からオルガネラの機能も測れる（Fig.2c）12,13)。薬理的な効果や細胞分裂時におけるタンパク質量の変化が定量で きる。
２.多重追跡（Fig.1d）
蛍光スペクトルの違いから複数の対象を同時に追跡できる。分 子ごとのスペクトル、細胞内における分布や動態がわかる （Fig.2d）14)。多重追跡は蛍光分子の改良やスペクトル分光技術 の進化により容易化した。回折格子（grating）と多チャネル検 出器を組み合わせて、蛍光スペクトルをリアルに再現したイ メージング手法が登場している15)。スペクトルピークに数 nmの波長差があれば何種類でも区別して、独立追跡できる。
Table1にライブステイニング用として代表的な蛍光色素を掲載した。何をみたいか？が決まれば、あとは特異性、波長特性な どを留意して選択すればよい。
１.蛍光タンパク：細胞に任意の遺伝子を導入することで、蛍光分子と標的タンパク質が結合した状態で発現する16,17)。生きた細胞が自身で産生する蛍光分子であるので自然な状態に近く、特異性も高い標識法である。蛍光スペクトルにおけるピーク帯域の色で名称が分類されており、主にCFP、GFP，YFP、RFP（DsRED）が汎用されている*3)。
２.蛍光標識剤：蛍光分子を修飾することで、細胞に発現している官能基と結合する。たとえばisothiocyanateやsuccimidyl esterはアミノ基と、bromoacetamide、maleimideはチオール基と結合する。蛍光団はcoumarin, fluorescein, rhodamine類が多く、これを改良した専用の蛍光ラベリング化剤があり、Alexa、Cyなどがある*2)。半導体ナノ粒子（Q dot）*4)も抗体用のラベル化剤などとして活用されている。これらラベリング化剤は明るくて退色が少ないのが特徴とされる。通常は蛍光をほとんど発さないが、光を照射した場所だけで特定波長の蛍光を発するようになる試薬もあり、caged fluorophores*2) やフォトクロミック分子18)がある。
３.マーカー：溶液として投与することで、細胞内に移動して酵素類と結合したり、ポンプで運搬されて特定の部位に濃縮されたりする19)。小胞体やミトコンドリアのマーカー酵素や核酸構造と結合するものがある。アクリジンオレンジのような陽イオン性蛍光物質は細胞膜を通過でき、プロトンポンプにより分泌顆粒内に蓄積する（Fig.2c）。
汎用されている蛍光プローブにおいて、大多数の波長範囲は可視光の領域であり、励起光(excitation, ex)は340～600nm、蛍光(emission, em)は400～650nmになる。可視域が汎用される理由を5つあげる。
１.肉眼で直接確認できるため標識の確認が容易。
２.対物レンズの色補正はC線（656nm）、F線（486nm）、g線（436nm）といった輝線を基準としており、この付近の波長におけるピントが最もよく合う。
３.励起光源としてのラインナップが豊富。ランプだけでなくレーザーの種類も増えている。ガスレーザーは波長488～630nmの帯域、固体ブルーレーザーは400～500nmをカバーしている。
４.励起光の生体に対する細胞傷害性が低い。紫外領域光は細胞内の核酸やタンパク質に吸収されやすく影響を及ぼす。
５.自家蛍光による背景光レベルが低い。
励起様式と蛍光検出は次のとおり、3種がある20)。
（１） 1波長励起1波長蛍光検出
（２） 2波長励起1波長蛍光検出
（３） 1波長励起2波長蛍光検出
（１） は最も手軽な測定であり、蛍光強度の分布測定に適する。強度の変化などを測る場合は同じ標本中における相対比較となる。（２） や（３）の2波長励起や検出では強度比（ratiometry）を計算することになる21)。Caイオン感受性蛍光色素fura-2は2波長励起1波 長蛍光（ex:340/380, em:510）であり、その蛍光強度は340nm励起でCa濃度に依存して上昇し、380nm励起で減衰する。両者の蛍光強度比（F340/F380）を算出することでS/N比があがる。 レシオ法は励起光強度や蛍光分子濃度などの測定条件による影響 や誤差を小さくできるという特徴があり、退色（photobleaching） による測定誤差も軽減される。
１.ダイナミックレンジ
同じ励起光量でも蛍光分子種によって明るさや変化幅（dynamic range）が異なる。イメージングにとって理想的な蛍光分子とは、コントロールでも十分に明るく、ダイナミックレンジも大きいものであろう。微量物質の測定感度を上げたい場合は、静止時では暗く、対象量の増大に依存して明るくなるタイプがよい。ただし静止時の蛍光強度は暗くなるため、低ノイズな検出システムが必要になる。静止時においても十分に明るい色素は細胞像をとるのは容易であるが、応答時における強度変化率は相対的に低くなるため、感度とビット数の高い検出器を選択するとよい。
２.溶媒やpHの効果
細胞内において均一に色素を負荷しても一様な明るさとはならない。細胞膜中の存在位置で明るさが変わる。これは蛍光分子の分布量の差もあるが、存在位置における環境による量子収率（2-2項）も関係している。因子としてはpHが相当に影響を及ぼすケースが多いので、pH7付近では蛍光強度が安定であるかどうか確認したほうがよい。
ライブステイニングでは蛍光分子と細胞膜の親和性や透過性の検討が必須である。細胞質、核やオルガネラを標識する場合では細胞膜を通過させなければならず、通常は疎水性、陽イオン性色素が有効である。細胞膜を通過できないような水溶性色素においてはカルボン酸基をアセトキシメチルエステル化（acetoxymethy
l ester, AM）することで細胞膜の透過性をあげることができる22)。Calcein-AMは細胞外では蛍光強度は低いが、細胞膜を通過して、エステラーゼによりAMが解離して水溶性となると蛍光強度があがる23)。この原理により細胞膜の状態がわかるので、生細胞の判定に用いることができる。
蛍光分子の生細胞への標識法について4つの手法をあげる。
１.バス染色（Fig.3a）
細胞外液に蛍光色素を負荷して目的の部位へ移行・結合させる。 固定後の標本に対する染色と異なり、細胞活性へ影響を与えな いよう染色条件を厳密とする必要がある。通常は室温～37度の 温度で、数分～1時間以内で染色を行うようにする。
２.トランスフェクション（Fig.3b）
目的とする分子を蛍光タンパクで標識として発現させるために 遺伝子DNAを細胞に導入する。トランスフェクションにはウイ ルスベクター法、リポソーム法、電気穿孔法、マイクロインジェ クション法などがある24)。細胞の蛍光強度分布から、遺伝子の 導入と発現が成功したかどうかを判定できる。失敗すると異常 な分布を示したり、時には死となる。生き残った細胞の中で蛍 光分布を比較して、適当と思われるものを選択して測定へ供す ることになる。
３.光刺激・活性化（Fig.3c）
任意の細胞または領域だけを標識したい場合に用いる。caged 蛍光色素、フォトクロミック化合物、光感受性タンパク質など が用いられ、光を照射した部位だけがマーキングされる（photoconversion, photoactivation）25)。光源は紫外領域光を 用いることが多いので光照射による毒性が少なくなるようにす る。
４.マイクロインジェクション（Fig.3d）
蛍光分子を細胞内へ移行できない場合に適用される。先端部が 鋭利なガラスピペットを細胞へ刺入し、細胞に影響がないよう 注意しながら加圧して色素を注入して色素を導入する。電気生 理測定用のパッチピペット26)やオートインジェクタが使用され る。細胞一個程度の標識となり、短期間における測定がむく。
１～４における共通の注意がある：1）至適濃度や温度など条件を 比較検討する、2）刺激や物理的ストレスを最小限とするようにする、3）標識が完了したらできるだけ早く測定に供する。
6．リアルタイム蛍光イメージングする
マークした対象をリアルタイムイメージングするための実際の 操作手順は以下の4ステップになる。
STEP1：励起（Fig.4a）
ライブステイニングした細胞に励起光を照射して蛍光を確認す る。光照射の方式は見たい領域・範囲・サイズなど測定の目的に 応じて変わるが、測定前の光照射ではできるだけ弱い光をあて、検 出器の感度を上げるとよい。
STEP2：細胞の選択（Fig.4b）
蛍光色素の種類に応じて基準は異なってくるが、初期状態にお ける蛍光強度分布や細胞自体の動きなどから選ぶことになる。蛍 光強度を選択基準とする場合は、明るいもの、中間程度のもの、暗 いものと分類し、測定結果から測定目的に合う蛍光強度の範囲を 決める。蛍光分子量が過飽和になる状態を蛍光色素負荷ではover load、蛍光タンパク発現ではover expressionとよぶ。こうなると細胞応答に依存した蛍光変化率が落ちる。Caイオンイメージン グではoverload時の場合や細胞の調子低下によって、蛍光強度が 上昇するので、生理機能に影響がないまま適度な強度を呈してい るものを見極める必要がある。
STEP3：刺激・応答（Fig.4c）
投薬または刺激によって細胞応答を誘導する。投薬は溶液の交 換、または急速注入・添加で行われる。溶液交換が測定に影響を 与える場合は、電気刺激、光刺激などで代替することがある。反 応したかどうか判定できない場合は、最大刺激による応答性の有 無をチェックする。応答が全く無い場合は蛍光標識が適当であっ たかどうかを再確認する。
STEP4：画像取得と解析（Fig.4d）
蛍光の明るさや波長に応じて検出器を選ぶ。蛍光が十分に明る ければCCDカメラでも良く、小型で使い勝手のよいデジタル CCDカメラを選択すればよい。やや暗い蛍光なら、高感度CCD カメラやイメージ増倍付CCDカメラがよい。非常に暗いもの・高 速検出する場合は、電子増倍式冷却CCDカメラまたはフォトマル （photomultiplier tube, PMT）となる。検出した蛍光イメージはデジタルデータとして記録すれば、蛍光強度（輝度）は8～16ビッ トの階調となり、単純な数値解析となる。特定の関心領域におけ る輝度の平均や偏差などを求め、時間方向やZ軸方向の数値変化 を求める。時間方向の解析によりタイムコース、Z軸の解析によ り3次元構築となる。
見たい標本へのマーキングや解析結果を4例紹介する。通常は 空間（XYZ）、時間（T）、波長（λ）の各軸に対する蛍光の強度や 分布といった5次元での解析となる。
PKCは細胞における生理機能制御系において重要なシグナル蛋 白質である。これまでに多くのサブクラスが同定されている。 PKCaは静止時において細胞質に存在しており、細胞への刺激に よって細胞膜へ移動することが知られており、GFPなど蛍光タン パク標識によりダイナミックな変化を視覚的にとらえることがで きる27、28)。静止時は細胞質が一様に明るく、刺激によって細胞膜 領域の強度が上がる(Fig.2a)。蛍光分子の移動をとらえるためには共焦点法が優れ、膜領域限定で測るには全反射法がよい。fura- 2法と組み合わせて、励起波長を切替えることでカルシウム信号と の同時追跡もできる29)。
Caイオンは代表的なセカンドメッセンジャーであり、これまで に多くのイメージング法が開発されてきた。Caイオン結合蛋白を 蛍光化したCFPとYFPの間でおこる蛍光エネルギー移動（FRET）によりCaイオン濃度を測定できる(Fig.2b)。通常はV帯（405～440nm）の励起光を用い、Ca濃度に依存してFRETがおこりCFP強度は低下、YFP強度は増加する。FRETを正確 に定量するためにはCFPとYFPの蛍光スペクトルにおけるクロ ストークをキャンセルするように演算するとよい。スペクトル分 光型の共焦点顕微鏡を用いることで、CFPとYFP信号のUnmixingができFRETを高S/N比で検出できる7, *5)。
オルガネラにはミトコンドリア、小胞体、ゴルジ装置などがあり、特異的な官能基またはマーカーへの蛍光標識で可視化できる。分泌小胞にはホルモンや神経伝達物質が蓄えられており、刺激に応じて外部に放出（exocytosis）される。小胞内容物への標識化、 または共存化で分泌小胞の動きや開口放出が見える。個々の小胞 は単一のスポットとして見え、exocytosisによって蛍光分子も放 出されて急激に消えてなくなる(Fig.2c)。全反射法によりインスリンが放出される瞬間などを確認することができる12)。
複数のオルガネラをスペクトル特性の異なる蛍光分子で標識す ることで、単一細胞における数種類の標的を同時に追うことがで きる。ミトコンドリアではcytchrome c oxidaseが、核では核移行シグナルがマーカーとなり、それぞれ異なる蛍光分子（たとえ ばDsRedやCFP）で標識する。Z軸方向にピントをシフトしな がらXY平面画像を取得してから再構成することで3次元（X・Y・Z）解析ができ、標本をピント面に対して垂直方向から眺めたよう な画像が得られる(Fig.2d)。共焦点法によりシャープな光学断層像を取得でき、オルガネラ同士の位置関係がクリアとなる。3次元 空間で複数の蛍光分子を追えば4次元（X・Y・Z・λ）解析となり、 時間方向を加えれば5次元（X・Y・Z・λ・T）解析となる。
蛍光標識や解析において主に3つの問題がある。
１.染色の不均一性
選択した色素と細胞の間における相性、または標識過程におけ る実験条件が影響する。前者はこれまで触れた量子収率の差が 大きいとされる。後者においてはオーバーロードと、予想外の 場所への移行化（コンパートメント化）がある。これらは意図 しない領域まで標識しまうことになるので、背景光やノイズ成 分となってS/N比が低下する。原因としては色素の溶解が不十 分、ロード時における温度条件が適当でないことがあげられる。 またロードに成功しても、色素が安定して存在し続けるわけで はない。代謝や排出などによって徐々に不活化・分散して消失 する。蛍光標識に成功したら、できるだけ早期に測定を開始し たほうがよい。
２.自家蛍光
生体において自然に存在する有機物も蛍光を発する30,31)。代表的なものとしては、リボフラビンやビタミンB6などのビタミン類、セロトニンやカテコールアミンなど神経伝達物質、トリプ トファンやチロシンなどアミノ酸類、NADHやFADなど補酵 素類がある。その他にポルフィリン、コラーゲン、フィブロネ クチンなども蛍光を発する。これら自家蛍光物質のほとんどは U帯～B帯に吸収をもつため、500nm以下の蛍光を検出するときは、無標識時に細胞が光っていないかどうかチェックする とよい。
３.退色や光毒性
分子に光を照射している限り、蛍光を発し続けるわけではなく、 徐々に退色していく。蛍光強度の低下だけなら検出器の感度を 変えるなどの対策で済むが、もう一方で一重項酸素（singlet oxygen）の産生が問題になる。一重項酸素はローズベンガル系 やポルフィリン系色素と光との反応でよく発生して光毒性 （phototoxicity）を呈することが知られており、癌の光治療（photo dynamic therapy, PDT）にも応用されている32,33)。すなわち退色と一重項酸素産生、そして一重項酸素と光毒性の双 方に相関がある。光を当てすぎはメリットが少ないので、余計 な光はできるだけ細胞に当てずに効率よく録ることに留意する。
今回はライブセル蛍光ステイニングについて特色や手法を解説
した。できることなら無染色・無標識のまま見たいが、蛍光マー
キングの利点が勝っている。したがって、より明るく・低毒性で、
長時間にわたって安定測定できるような照準造りをめざしてほし
い。照準として選択する蛍光分子の種類は研究目的やイメージン
グ機器に応じて選ぶことになる。蛍光分子の物理化学性質を目安
に選択し、細胞における強度分布や応答から実験に最適となるよ
う染色条件を整えていただきたい。次回は本項でも少し触れたCa
感受性蛍光色素を用いた細胞内Ca濃度イメージング法について紹
介する。
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