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落谷 孝広 （Takahiro Ochiya, Ph.D.） 国立がんセンター研究所 がん転移研究室 |
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落谷 孝広 （Takahiro Ochiya, Ph.D.） 国立がんセンター研究所 がん転移研究室 |
[Abstract]
Silencing gene expression by siRNAs is rapidly becoming a powerful tool for the experimental analysis of tumor inhibition. Previous research has shown that siRNAs can specifically reduce the expression of genes in certain types of cancers, but siRNA delivery strategies, such as viral- or lipid-based vectors, have had varied success and are prone to activating deleterious immune responses. Atelocollagen is a highly purified type I collagen that is modified to have low immunogenicity. Atelocollagen complexed with siRNA is resistant to nucleases and is efficiently transduced into cells, thereby allowing long-term gene silencing in vivo. Here we introduce our attempts on atelocollagen-mediated delivery of synthetic siRNAs into mice with tumor metastasis and discuss therapeutic potential of RNAi.
キーワード：RNAi(RNA interference), siRNA, delivery, metastasis, cancer
RNA干渉(RNAi)という現象の発見のもととなったのは1990年代はじめに植物で見つかった転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)、あるいはウイルス誘発性遺伝子サイレンシング(VIGS)と呼ばれる現象である。RNAiが動物である線虫で初めて報告されたのは1998年、まだ記憶に新しいところだが、その後、魚類や昆虫、そして哺乳類でも次々とその存在が報告された。RNAiをもとにした治療法はウイルス感染症からがんに至るまで幅広い疾患をカバーする。2005年暮れにはすでに米国のSirna Therapeutics 社が加齢性黄斑変性症に対するsiRNA製剤を用いた第1相臨床試験の良好な結果を公表した。しかし、その多くは合成のsiRNAによる局所の病変を対照とした投与に限られ、感染症や転移性がんの治療に必要な全身性の投与方法についての具体案は提示されていない。siRNAの臨床応用の成否を握るのが、生体へのデリバリー技術である。培養細胞レベルの研究では目的の抑制効果を示すsiRNAであっても、適切なデリバリー方法を用いなければ、動物実験では全く効果がみられない場合が多い。我々は導入効率が高く、安全面でも優れている核酸医薬デリバリーシステムの開発を目指し、生体親和性物質であるアテロコラーゲンに着目して検討を行ってきた。ここでは、アテロコラーゲンと合成siRNAの複合体による転移性がんの治療に関する知見を中心に紹介し、siRNAの全身性投与の有用性について考察する。
RNAiとは2本鎖RNA(dsRNA)によって引き起こされる配列特異的な遺伝子発現抑制の現象である。生体内に導入されたdsRNAは、RNase
ファミリーに属するDicerと呼ばれる酵素により、3'末端側に2塩基の突出をもつ21塩基のdsRNAであるsiRNA(short interfering RNA)にプロセッシングされる。siRNAはRNA-ヌクレアーゼ複合体であるRISC(RNA induced silencing complex)によって2本鎖がときほぐされた後にアンチセンス鎖がとりこまれて、そのアンチセンス鎖に相補的な配列をもつRNAを選択的に分解する。Nature publishing グループはweb上でこのプロセスの詳細をアニメーションで紹介している（http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html）。
このRNAiに先行して進んでいたのが同じ核酸医薬として開発されていたアンチセンス医薬である。しかし、デリバリー等の問題が引き起こす副作用を上回るほどの有効性を示す結果が臨床上得られず、最終的な承認に届かなかった例が多い。米国のIsis社等のいくつかのベンチャー企業はアンチセンス試薬の開発を続けてはいるものの、RNAi分野で続々と示される抑制の強さと確かさにアンチセンスはかないそうもない。それは、siRNAの持つ1）標的遺伝子に対する高い特異性、2）リスクに取り込まれた一本鎖RNAは使い捨てではなく、連続して標的遺伝子を攻撃するため、毒性の生じにくいごく微量で確実な抑制効果を生む、という２つの理由による。これに加えて、アンチセンスではその配列の決定を多くは経験則にもとづく不確定なものであったのに対し、確実に標的遺伝子の発現を抑制しうるsiRNAのデザインが、簡単なソフトによる検索で、誰にでも簡単に行えることも、RNAiの普及の大きな要因のひとつである。しかし、その研究の歴史が浅い故に、メカニズムを完璧に解明できたとは言えず、思わぬ副作用を招くことがないよう、臨床応用には慎重さが求められるのも事実だ。
siRNAの有用性はすでにがん治療の領域でも示されている（表1）。がんでは、がん遺伝子、がん抑制遺伝子などのがん関連遺伝子に変異が起こることにより細胞の異常が生じると考えられている。siRNAを用いることによりこの変異が起きた遺伝子の発現を特異的に抑制し、腫瘍の増殖を阻止することが目的である。さらに、がん細胞に栄養を供給する血管を標的にしたsiRNAや、がん細胞にアポトーシスを誘導するようなsiRNAを導入することも盛んに検討されている。このようにがんの原因となる遺伝子の発現を直接抑制する方法の他に、RNAiによる治療法は抗がん剤等の化学療法のサポートシステムとしての利用が考えられている。例えばImperial College Londonの研究チームは、多剤薬剤耐性を担う遺伝子をsiRNAで抑制することで、白血病細胞の薬剤に対する感受性を回復させ得ることを報告している。さらに、最近ではsiRNAライブラリーが各社で開発され、それを用いたスクリーニングにより、新しいタイプのがん標的遺伝子の同定が相次いでいる。
RNAiによる治療研究を進める上での最初のステップは目的とする遺伝子に対するsiRNAのデザイン、in vitroでの評価系の作成である。まずどのような細胞で、最も効果のあるsiRNA配列を選ぶかが研究全体の質を左右する。ここでの注意点は、培養細胞へのsiRNAの導入方法と、動物個体での導入方法をできるだけ一致させることである。次のステップはin vitroでのデリバリーとその評価系の構築である。まず生体内へ投入する場合の最初の問題は、いかに血中や組織中でのsiRNAの安定性を図るかという点である。これまで考案されている方法で効果が良さそうなのはsiRNA自体の化学修飾によるヌクレアーゼ耐性の強化であり、複数のベンチャーからすでに製品化されている。このヌクレアーゼに対する抵抗性は、リポソームとの結合や、後に紹介するアテロコラーゲンのようなデリバリーキャリアーとの複合体を形成した場合にも同様に観察され、血中での安定性の程度を測る上で重要な指標となる。次は生体内でのsiRNAのデリバリーや標的遺伝子の発現抑制、あるいは腫瘍の縮小等の生物学的効果の評価系の選択である。これには様々な方法があるが、我々は発光イメージングを主体とした評価系を用いている。これは動物に移植するがん細胞自身が例えばルシフェラーゼを発現するように細工しておき、siRNA のデリバリー効果の判定にはルシフェラーゼを抑制するsiRNAを用い、ルシフェラーゼ量（フォトン数）を測定することで、目的の細胞へsiRNAがどれだけ到達したのか判別できる。さらにがん細胞の増殖に関する遺伝子を標的としたsiRNAをデリバリーすることで、がん細胞そのものの増殖抑制も、やはりルシフェラーゼを指標に定量化が可能だ。しかし、このなかでやはり最大の問題点は、いかに効率よく、しかもインターフェロンや炎症性サイトカインなどの非特異的な生体の反応を惹起せずにsiRNAをデリバリーできるかどうかである。
siRNAのデリバリーに関しては、動物個体レベルでも既に多くの試みがなされている（表2）。例えばマウスの尾静脈から合成siRNAを体重の10％もの大量のPBS溶液で数秒の短時間で注入するハイドロダイナミックス導入法で、動物の肝細胞へのsiRNAの導入に成功したとの報告がある。しかし、このような生体のホメオスタシスを無視した方法はヒトには到底適応できるものではない。また長期の抑制効果にはウイルスベクターが必要となる。これまでにアデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターに組み込んで作製したsiRNA発現ウイルスベクターを用いて、動物個体へのsiRNA導入の報告が次々とされているが、臨床応用可能なsiRNAのin vivoへのデリバリー方法はいまだ確立されていない。リポソーム製剤もsiRNA用に開発が進み、我が国の日本新薬のカチオニックリポソームは臨床応用を目指している。以下に、siRNAの生体へのデリバリー方法として、我々日本の研究チームが独自に開発したアテロコラーゲンDDSを紹介する。
アテロコラーゲンはウシの真皮から抽出した、
型コラーゲンを原料としている。型コラーゲンは3本のポリペプチド鎖が、らせん状構造を形成しており、長さ300 nm、直径 1.5 nmの棒状の分子である。N-、C-両末端には、大部分の抗原性を有するテロペプタイドと呼ばれるアミノ酸領域があり、アテロコラーゲンは、ペプシン処理によってテロペプタイドを消化切断して精製するため、生体へ投与しても免疫応答を惹起したり、毒性を示す可能性はきわめて低い。実際に、軟組織陥凹部の補正修復など様々な医療現場で使用されており、人体への安全性が確認されているバイオマテリアルである1）。アテロコラーゲンは低温（2-10
）では液体（ゲル状）であるため、核酸溶液と混合することが可能である。アテロコラーゲンは正に荷電しているため、負に荷電している核酸分子と静電気的に結合し、複合体を形成する2）。この際、20ヌクレオチド前後の小さな核酸分子であるアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNAとは、細胞に取り込まれやすいナノサイズの粒子を形成すると考えられている3）。これらはあらかじめプレート上に固定化することが可能なことから、細胞での核酸医薬の機能をハイスループットに解析できるリバーストランスフェクションとしての有用性も証明された4−7）。
線維芽細胞増殖因子であるHST-1/FGF-4依存的に増殖するヒト精巣腫瘍細胞をヌードマウスの精巣に移植し、HST-1/FGF-4に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS-ODN）とアテロコラーゲンの複合体を、直接精巣腫瘍に投与したところ、腫瘍の増殖および他臓器への転移を抑制した8）。マウスにマウス直腸がん細胞を移植し、ミッドカインに対するAS-ODNとアテロコラーゲンの複合体を頻回投与した結果、AS-ODN単独投与に比べて強力にがん細胞の増殖を抑制できたことが名古屋大学の武井博士らによって報告されている9、10）。また、熊本大学の安東博士らのグループは家族性アミロイドニューロパチーの原因遺伝子であるトランスサイレチン遺伝子の特定の塩基を変換する方法に、オリゴヌクレオチドとアテロコラーゲンの複合体を適用した結果、変換効率は培養細胞で11%、マウスの肝臓で8.7%であった11）。一方、オリゴヌクレオチド単独では、このような変換はみられず、アテロコラーゲンデリバリーシステムが、オリゴヌクレオチドによる塩基変換効率の向上に寄与し、遺伝子疾患の根本治療に有用であることが示唆された。
siRNAの局所投与に関しては、ヌードマウスの皮下や精巣に移植した腫瘍に、直接siRNAとアテロコラーゲンの複合体を投与し、その効果がsiRNA単独よりも持続し、より高い腫瘍増殖抑制効果を示すことが確認された12）。また、ヌードマウスの皮下に移植したヒト前立線癌細胞の増殖を、VEGFに対するsiRNAとアテロコラーゲンの複合体を投与することで、顕著に抑制できることを報告し、その機序として、複合体の形成により、細胞への取り込み効率が高まると共に、siRNAの半減期が延長されることが報告された13）。
マウスの末梢部位に炎症を実験的に惹起し、ICAM-1に対するAS-ODNとアテロコラーゲンの複合体をマウスの尾静脈投与によって、炎症抑制効果を確認し、その効果は投与後3日以降も維持された14）。この事実は、アテロコラーゲンDDSが全身性の核酸医薬のデリバリーに優れていることを示唆している。そこで、ヒト前立腺がん細胞を、ヌードマウスの左心室に移植して骨転移モデルを作成し（図1）、尾静脈投与によってsiRNAとアテロコラーゲン複合体が、骨を含めた全身の転移巣へとデリバリーされるかを検討した。その結果、siRNA単独投与では標的遺伝子産物の抑制効果は40%以下であるのに対し、siRNAとアテロコラーゲンの複合体の投与では、90%以上の効果がみられ、骨転移巣へのデリバリーにも、アテロコラーゲンが適用可能であることが示された15）。さらに前立腺がんの悪性度に関与する2つの遺伝子、EZH2とp100alphaに対するsiRNAのアテロコラーゲンによるデリバリーは、骨転移腫瘍の増殖を顕著に抑制することもわかった（図2）。この2つの標的遺伝子は、前立腺がんのみならずヒトの乳がんの悪性度にも関連するとの報告がある。これらの研究は、siRNAの全身性のデリバリーシステムとしてがん転移モデルでの始めての報告例である16）。ただし、同転移モデルマウスでは、骨転移腫瘍部位の他に、正常の多くの臓器へのsiRNAのデリバリーも同時に確認された。がん治療でのデリバリーの問題点のひとつはいかに正常部位への影響を少なくして、目的とするがんにのみ到達できる方法を選択することであり、この点ではアテロコラーゲンDDSによる全身性投与法もヒトへの応用に関してはまだ越えるべき大きな壁があるのが現状だ。
アテロコラーゲンDDSが、合成siRNAの局所及び全身性のデリバリーに有用であることを述べた。この投与方法では、動物個体に対してインターフェロンやインターロイキンなどの有害な反応を惹起することも無く、安全な方法であるといえる。しかし、核酸分子とアテロコラーゲンの複合体に、腫瘍標的性を発揮する何らかの修飾を施し、正常臓器への波及をできる限り少なくしたより安全性を高める工夫をする必要がある。欧米を中心に核酸医薬、特にsiRNAの臨床開発はさらにスピードアップされると思われる。我が国でも、リポソームやバイオマテリアルなどの独自の優秀な技術やsiRNAのデザインシステムを武器に、がん領域における新たな治療戦略の開発が実るよう期待したい。
参考文献
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15) F. Takeshita, Y. Minakuchi, S. Nagahara, et al., "Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2005, 102, 12177-12182.
16) Research Highlight, "RNA interference delivers", Nature, 2005, 436, 892.
略歴
| 氏名 | 落谷 孝広（Takahiro Ochiya） |
| 所属 | 国立がんセンター研究所 がん転移研究室 |
| 連絡先 | 〒104-0045 中央区築地5-1-1 TEL：03-3542-2511（内線4452） FAX：03-3541-2685 |
| 現在の研究テーマ | 1）ステム細胞から肝細胞の分化メカニズム解明と再生医療への応用 2）ラットES細胞の開発とがん基礎研究への応用 3）アテロコラーゲンDDSによるがん治療研究 |
| 1988年大阪大学大学院博士課程修了、医学博士。
1988年-1992年まで大阪大学細胞工学センター助手。 1991-1992年、米国ラホヤ癌研究所（現・バーナム研究所）ポス ドク。 1992年、国立がんセンター研究所・分子腫瘍学部、主任研究員、 1998年より同・がん転移研究室（省令室）・室長。 2004年より早稲田大学生命理工学部客員教授。
JB, JDDR, DDTなどの編集委員。日本癌学会評議員。 2000年、日経BP賞バイオ医学部門賞受賞（アテロコラーゲン DDS）。 2002年、2003年、日本再生医療学会優秀演題賞受賞。 |
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