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試作品
微生物検出キット（蛍光）
-Bacstain- CTC Rapid Staining Kit for Flow cytometry, for Microscopy

　細菌検出用の蛍光試薬として、EB, DAPI, SYBR Greenなどのような生・死全菌染色剤、Invitrogen 社の LIVE/DEAD®BacLight™ Bacterial Viability Kit（以下、BacLight）に代表されるような、生・死二重染色キットが汎用されています1-3)。BacLightは細胞膜透過性の異なる2つの核染色試薬（SYTO 9 及び PI）により同時染色することで、生細胞（膜損傷なし）及び死細胞（膜損傷あり）を見分けます。このように膜損傷の有・無で細菌の生・死判定を行います。

　一方、CTCは呼吸活性による電子伝達系により還元され、蛍光性のformazanを生成するという特性をもちます。この菌の代謝に応じ蛍光を発する点で注目され、生菌に選択的な蛍光試薬として汎用されてきましたが、染色性が悪いという問題を抱えておりました。

　この度、小社で開発しました -Bacstain- CTC Rapid Staining Kit は、CTC染色時にenhancerを加えることで、CTCでの染色をより迅速・高感度にできるキットです。CTC単独では染色されなかった乳酸菌や真菌おいても、同キットにて染色されることが確認できました。

＜特長＞
  • スピーディーで高感度な生菌のCTC染色が可能です。
  • 少量小分け品ですので使いやすくなっております。

＜キット内容＞　※各100 assay用
　for Flow cytometryとfor Microscopyの2種類をご用意しておりますので、検出系にあったキットをお選び頂けます。

for Flow cytometry
  • CTC　　10 mg×3 tubes
  • enhancing reagent A （DMSO solution） 　0.1 ml

for Microscopy
  • CTC　　10 mg×3 tubes
  • enhancing reagent B （aqueous solution）　　0.5 ml

＜本キット以外に必要なもの＞
  • マイクロピペット
  • インキュベーター（25〜37℃）
  • マイクロチューブ
  • 遠心機（マイクロチューブ用）


Flow cytometry

CTC Rapid Staining Kit (for Flow cytometry)とI社キットとの染色能比較
※細胞密度，CTC終濃度，インキュベート時間及び温度はすべて同一条件
※488 nm励起、検出波長670〜735 nm


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Microscopy

　培養した細菌懸濁液を遠心分離し上清（培地）除去後、PBS(-)に再懸濁した。
　CTCのみ又はCTC + enhancing reagent Bを添加した。
　37℃で1時間インキュベートした後、プレパラートを作成し蛍光観察（B励起）した。

Staphyrococcus aureus subsp. Aureus　（×400）
CTCだけでの染色 CTC + enhancing reagent Bでの染色

Klebsiella peneumoniae　（×400）
CTCだけでの染色 CTC + enhancing reagent Bでの染色

　福岡県工業技術センター生物食品研究所のご指導、ご協力のもと染色実験を行いました。


染色例

CTCによる菌の染色例を下記に示します。
対比染色として、SYBR® Green 1を用いております。

50％live B.cereus CTC-SYBR® Green 1 B 励起(400倍)

Staphyrococcus aureus CTC-SYBR® Green 1 B 励起(400倍)


参考文献

1)　染谷 孝，“蛍光染色による土壌微生物の検出法”，月刊 海洋 培養不能細菌 -VNC研究の現状と課題-，2003, 33, 14．

2)　平石 明，吉田 奈央子，“活性汚泥における培養不能な細菌の検出”，月刊 海洋 培養不能細菌 -VNC研究の現状と課題-，2003, 33, 48．

3)　M. Kawai，N. Yamaguchi and M. Nasu, J．Appl．Microbio．，1999，86，496．

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関連製品

その他、核染色剤として使用される製品をご紹介いたします。

-Cellstain- DAPI
-Cellstain- DAPI solution

　DAPIは蛍光顕微鏡下、酵母のミトコンドリア、葉緑素、ウイルス、マイコプラズマ、染色体中のDNA検出に使用されている。460 nmに青色の蛍光を持ち（励起波長360 nm）、DNAのAT配列に特異的なminor grove binderである。

S.aureus DAPI(終濃度1μg/ml)UG励起、4％ホルマリン固定

-Cellstain- PI
-Cellstain- PI solution

　Propidium iodide（PI）はDNAの二重らせん構造にintercalateすることにより特有の赤色蛍光が増強される核酸染色色素である。一部は二本鎖構造のRNAとも結合するため、正確なDNA染色を行うには、二本鎖構造のRNAの除去が必要である。一般に生細胞の細胞膜は透過せず、死細胞にのみ入り込み核内のDNAにintercalateし赤色蛍光を発する。したがって死細胞染色色素として利用され、フローサイトメトリーへの応用例も数多い。

-Cellstain- EB
-Cellstain- EB solution

　PIと同じくphenanthridium系染料に分類されるカチオン性の蛍光色素である。DNAの二重らせん構造にintercalateすることにより特有の赤色蛍光が増強される核酸染色色素である。


品名 容量 価格(￥) コード メーカーコード
-Cellstain- DAPI 1 mg 3,800 342-07431 D212
-Cellstain- DAPI solution 1 ml 4,800 340-07971 D523
-Cellstain- PI 1 mg 3,800 343-07461 P346
-Cellstain- PI solution 1 ml 4,800 341-07881 P378
-Cellstain- EB 1 mg 3,800 346-07451 E262
-Cellstain- EB solution 1 ml 4,800 348-07891 E272


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