新規化合物を用いたROSの検出
株式会社同仁化学研究所 園田 晋也
白石 賢央
活性酸素種(reactive oxygen species : ROS)は多くの生理的過程のみならず、呼吸器疾患、神経疾患、老化、癌などの様々な疾患病態の発症・進展への関与が示唆されており、生命化学の幅広い研究領域で注目を集めている低分子群である。
これらのROSの測定においては、比色法、蛍光法、化学発光法や、不対電子を直接検出する電子スピン共鳴(electron spin resonance : ESR)など様々な方法がある。今回はその中でも、蛍光法で用いる新規蛍光プローブと、ESR-スピントラッピング法で用いる新規スピントラップ剤を紹介する。
新規蛍光プローブを用いた生体内H2O2のイメージング
〜蛍光プローブを用いた H2O2の検出〜
ROSの一種である過酸化水素(H2O2)はスーパーオキシド（O2-）のスーパーオキシドジスムターゼ(superoxide dismutase:SOD)による反応産物として知られ、酸化ストレスの指標となっている。また、mitogen-activated protein(MAP) kinaseのようなリン酸化酵素、nuclear factor κB(NF-κB), activating protein 1(AP-1)のような転写因子、protein tyrosine phosphatases (PTPs)、ion channels、G proteinsなど細胞増殖や細胞死を制御するシグナルタンパク質へのセカンドメッセンジャーとしての役割を担っていることも知られている。このような重要なファクターであるにもかかわらず、その発生、伝達、作用のメカニズムは未だ不明な点が多い。
ROSの生体内での役割を明らかにするためにESR法、吸光法、蛍光法、化学発光法など種々の検出法が開発されてきた。その中でも、蛍光プローブを導入した生細胞を蛍光顕微鏡下で観測する方法(蛍光イメージング法)は、生きている状態での生物応答を感度良く、リアルタイムで、空間分解能高く捉えることができる点で優れており、近年注目を受けている方法である。
蛍光イメージングを行う際、検出対象分子を可視化する蛍光プローブの存在が不可欠である。2’,7’-ジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)、ジヒドロローダミン123、ジヒドロエチジウムなどは、高い検出感度を持っているが、励起光をあてるだけで著しい蛍光強度の増大が以前から起こり、また全てのROSと反応するという選択性の乏しさが問題となっていた。近年、これらの問題を克服した新規蛍光プローブの開発が進められており、報告例も数多い1-3)。
その中から今回、J. Changらが開発した 2種類の H2O2選択性蛍光プローブを紹介する。
最初に紹介する例は、Fig. 1に示すPeroxy Lucifer 1（PL 1）である4)。
Fig. 1 PL 1の構造及び反応式
PL 1は大きな二つの特性を持っている。まず第一に、高いH2O2選択性を持つことである。これは、boronate骨格を有するカルバメート基の脱保護がH2O2に対して選択的に起こるためで、他のROS（TBHP:t-butyl hydroperoxide,O2-・,NO+,●OH,●OtBu,-OCl,1O2）では脱保護がほとんど起こらない。第二に、ratiometric probeという点である。PL 1は、母核構造である Lucifer Yellowのアミノ基に電子吸引性のカルバメート誘導体が導入されているが、H2O2との反応によりカルバメート基が脱保護されLucifer Yellow誘導体に戻ると、内部電荷移動遷移(internal charge transfer)効果により、蛍光極大波長が顕著に長波長シフトする（青色蛍光 475nm→緑色蛍光 540nm,Fig. 2）。この特性を利用すれば、適当な二波長を選択して励起し、その時の蛍光強度の比をとることで、細胞内の環境や導入した試薬濃度に左右されることなく、H2O2濃度と対応づけることができる。
Fig. 2 H2O2反応後の蛍光スペクトル
また、J. Changらは、RAW264.7マクロファージを phorbol myristate acetate (PMA)で刺激した後、PL 1を導入して、マクロファージ内の蛍光変化を二光子顕微鏡で観察した。
その結果、マクロファージ内の細胞質における緑色蛍光と青色蛍光の強度比率（Fgreen / Fblue）が0.6であったのに対し、H2O2が産生したマクロファージ内の小嚢では緑色蛍光の強度比率が増大した（Fgreen / Fblue = 1.0）。この実験より PL 1が、細胞内で起こる免疫応答によって発生したH2O2を検出するのに、十分な感度を持っていることが分かった。
次に紹介するのは、Fig. 3に示す MitoPY1である5)。
Fig. 3 MitoPY1の構造及び反応式
MitoPY1は二つの大きな特性を持っている。まず第一に、前述のPL 1と同様にH2O2に選択性を持つことある。これは boronateの H2O2特異性に基づくもので、他の ROS に対しては脱保護が起こらず、H2O2に対してのみ脱保護が起こる。
第二の特性は、ミトコンドリアに選択性を持つことである。ミトコンドリアは生体内酸素の90%以上を消費して、生命活動に必要な エネルギー ATP）を供給する細胞内小器官であるが、消費酸素のうち数%を活性酸素種とし産出するため活性酸素生成器官としても認識されている。近年は、アポトーシス制御にミトコンドリアが関与していることが判明し、ミトコンドリアの酸化ストレスを起因とする疾病が数多く報告されていることから更にミトコンドリアが注目を受けている。
J. Changらは、phosphonium head を導入することでミトコンドリアへの選択性を見出した。実際、彼らは HeLa細胞内に MitoPY1を導入して共焦点顕微鏡で観察すると、ミトコンドリアに MitoPY1が集積していることを確認している。
更にJ. Changらは、ミトコンドリア内で産生した H2O2の検出にも成功している。HeLa細胞を除草剤の一種であるパラコート（酸化還元サイクルを形成し、スーパーオキシドを生成する薬剤）に曝した後、MitoPY1を導入して共焦点顕微鏡で観察した。その結果、パラコート処理をしない対照実験と比較して、明らかにMitoPY1による蛍光強度が増大していた。この結果よりMitoPY1はミトコンドリア内のH2O2を検出するのに十分な感度を持つことが判明した。
今回紹介した 2つの化合物は、H2O2選択性を持ち、低毒性、高感度であることから、細胞内イメージングに適しているという優れた性能を有している。今後、 PL 1, MitoPY1を用いた実験や、これら化合物を基にした、より優れた機能を持つプローブが開発されることにより、H2O2の生理学的、病理学的な役割の解明に繋がることが期待される。
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新規ラジカル補足剤の生物学的系における有用性
〜ESRを用いたROSの検出〜
スーパーオキシドラジカル（O2-・）は細胞内の代表的な ROSの一つであり、化学的、生化学的、細胞生化学的な in vitro測定法や in vivo測定法など、様々なO2-・の測定法が開発されているが、その中でも、ESRを用いた分析方法は ROSのさまざまな作用を直接的、かつ定量的に測定する方法の一つである。したがって、 ESRを用いたROSの測定は化学系、生物系の様々な系におけるフリーラジカルの動態を研究する上で、非常に価値のある方法である。しかしながら、ESRを用いた測定方法は、O2-・やヒドロキシルラジカル（・OH）のように不安定で半減期が非常に短いフリーラジカルを直接検出するには不十分であるため、スピントラップ剤を用いてフリーラジカルを安定なラジカルに変換する必要がある。
2,2-Dimethyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole N-oxide（DMPO）はO2-・の検出で頻繁に用いられているスピントラップ剤であるが、これがO2-・をトラップして生成するスピンアダクト（DMPO-OOH）は半減期が1分以下で、スピンアダクトの分解や、金属イオンの存在下で・OHのスピンアダクトと同じDMPO-OHに変化してしまうという欠点がある。
それらの欠点を改善するため、近年、新規のスピントラップ剤として 2-Diphenylphosphinoyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole N-oxide（DPhPMPO）が開発された。本稿ではT. Karakawaらによって検証されたDMPOとDPhPMPOの性能の比較と、その応用性を紹介する。
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１．X/XO系におけるDMPOとDPhPMPOの比較
キサンチン（xanthine：X）/キサンチンオキシダーゼ（xanthine oxidase:XO）系により生成される O2-・をDMPOとDPhPMPOでトラップさせたスピンアダクト（それぞれ、DMPO-OOH、DPhPMPO-OOH）の ESRスペクトルと、その信号強度の比較をFig. 1に示す。
Fig. 1 各スピンアダクトのESRスペクトル及び信号強度
それぞれの超微細結合定数（hyperfine coupling constant）は、DMPO-OOHが aN＝1.43 mT、 aHβ＝1.15 mT、 aHγ＝0.13 mT、 DPhPMPO-OOHが aN＝ 1.26 mT、 aHβ＝ 1.10 mT、 aP＝ 3.90 mT となり、得られたスペクトルは O2-・由来であることが確認された。また、 DPhPMPO-OOHの信号強度は DMPO-OOHのそれよりも高く、DPhPMPOの O2-・に対する検出能力は、DMPOと比較して優れていることが示されている。
DMPOと DPhPMPOの共存下に X/XO系を用いて O2-・を発生させると、ESRスペクトルにおいてDPhPMPO-OOHとDMPO-OOHをほぼ重ね合わせたスペクトルが確認された。（Fig. 2）。
Fig. 2 DMPO-OOHとDPhPMPO-OOHのESRスペクトル
次に、上記のO2-・発生系でスピントラップ剤の濃度比を変えて実験を行い、スピントラップ剤の濃度比（【DPhPMPO】/【DMPO】,横軸）に対するそれぞれのスピンアダクトの存在比（RDPhPMPO/RDMPO,縦軸）をプロットしたところ直線が得られ、その傾きからO2-・に対するそれぞれスピントラップ剤の反応速度定数を算出した。その結果、kDPhPMPO=48 M-1s-1、 kDMPO=15 M-1s-1が得られ、O2-・に対する反応性はDMPOよりもDPhPMPOのほうが優れていることが確認された。
さらに、DMPO、DPhPMPOについて、O2-・とのスピンアダクトの半減期を確認するために以下の実験を行っている。X/XOの系で生成したDPhPMPO-OOHアダクトの信号強度の径時変化を確認した結果、DPhPMPO-OOHの半減期は6.2±0.36min.となり、DMPO-OOHの1.5±0.1min.よりも長く、DPhPMPOの方がより安定なスピンアダクトを形成していることが確認された（Fig. 3）。
Fig. 3 DPhPMPO-OOHアダクトの信号強度の時間変化
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２．細胞内O2-・生成系におけるDMPOとDPhPMPOの比較
Phorbol myristate acetate（PMA）はプロテインキナーゼ C（PKC）やNADPHオキシダーゼを活性化し、好中球のROS生成を誘導する物質として知られている。PMAによって活性化された好中球が生成するO2-・をDMPOまたはDPhPMPOでトラップさせた結果、DMPOを用いた実験におけるESRスペクトルからはDMPO-OOHとDMPO-OHの二種類のスピンアダクトの存在が確認されている。これは細胞に含まれるグルタチオン/グルタチオンペルオキシダーゼ等によって、DMPO-OOHがDMPO-OHへと変化しているものと考えられる。一方、DPhPMPOのESRスペクトルでは、X/XO系で得られるものと類似の超微細結合定数のみが確認されているため、スピンアダクトDPhPMPO-OOHはDPhPMPO-OHへと変化しないことが確認された。
O2-・のトラップ能力は、細胞内においてもDPhPMPOのほうがDMPOよりも優れていたが、X/XO生成系とは異なり、DPhPMPO-OOHのスペクトル強度がDMPO-OOHと比較して2倍程度しか高くなかった（Fig. 4）。この原因は、DPhPMPO-OOHの疎水性によるものと考えられる。
Fig. 4 細胞内における各スピンアダクトの信号強度
DPhPMPOとDMPOの1-オクタノール／水に対する分配係数（Kp）はそれぞれ4.3,0.1であり、これは前者のほうが疎水性が高いことを示しており、細胞内に留まりやすいと推測される。たとえば、7.6という高いKpをもつ別のスピントラップ剤であるDEPMPO（5-diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrrolineN-oxide）は、細胞内で生成したO2-・を検出することができない。高い疎水性が細胞内での分布を高めるということから、Kpはスピントラップ剤にとって重要なパラメーターである。
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まとめ
以上のように DPhPMPOの O2-・に対する反応性は、DMPOと比較して明らかに高く、生成したスピンアダクトの安定性も高いことが確認された。また、生成した O2-・アダクトが ・OHアダクトに変化しない性質を持ち、細胞内生成系でも十分に測定が可能であることも確認されている。
さらに、DPhPMPOは室温において白色の固体で、保存が容易で扱い易いうえに水溶液中で数ヶ月間安定であるという利点を持つ。この点についても、 DPhPMPOが DMPOに対して優れていることを示している。
結論として、DPhPMPOは細胞系・無細胞系におけるスピントラップ剤としてDMPOよりも優れていると考えられる。今後、生体内で起こる様々な生理的過程で生じるフリーラジカルの動態を研究する上で、DPhPMPOの活躍が期待される。
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参考文献
T. Karakawa, K. Sato, Y. Muramoto, Y. Mitani, M. Kitamado, Biochem. Biophys. Commun., 2008, 370, 93-97.
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