GTP エネルギー代謝機構 細胞内GTP センサー・PI5P4Kβの発見とガンや代謝疾患への新たな治療戦略

Abstract
Guanosine-5'-triphosphate (GTP), a building block of nucleic acids, also provides energy that drives protein synthesis and the cytoskeletal system. Cellular GTP concentrations relative to ATP vary substantially among tissues and increase significantly in multiple cancer cells. Our previous and ongoing studies have shown that life evolved the GTP energy utilization for new cellular functions, and its dysregulation leads to various pathological conditions, such as cancer and metabolic diseases. Here, we GTP-GEEKS will introduce new biological functions from the perspectives of GTP - its involvement in cancer, metabolic diseases, and stress regulation. Our emphasis is also on the efforts to promote an interdisciplinary research on GTP energy metabolism beyond the boundaries of nations and specialties.

1． はじめに：酵素電極反応

“What if life restarts again?”
　生命の定義の一つたるエネルギー代謝に、ATP を代表としたリボヌクレオチドは深く関わっている。例えば、脂質合成はCTP、糖鎖合成はUTP によりなされ、ATP はそれらを支える基盤として働く。我々が取り組んでいるGTP は、細胞の主要成分のひとつ「タンパク質」の合成を駆動するエネルギー分子である。しかしながら、なぜ生命の発生そして進化の過程でGTP が「タンパク質」の合成を駆動するようになったのだろうか? 生命はGTPをATP などと使い分けることで、どのように機能を拡張し、その進化を可能にしてきたのだろうか? ダイナミックに変動するGTP エネルギー代謝を支える仕組みとその変動が持つ意味はなんだろうか?
　我々GTP-GEEKS は、GTP にまつわるこれらの謎に取り組むことで、生命システムの根源的な理解を目指して研究に取り組んできた。その最初の大きな成果は、細胞内のGTP 量を感知する“GTP センサー”が哺乳細胞に備わっていることを見出したことである^1-4）。GTP センサーの正体は、脂質キナーゼであった。驚くべきことにこの脂質キナーゼは、GTP を基質としてリン酸転移反応を行う特異な性質を持っており、キナーゼは基質のリン酸化にATP を用いるという既成概念を打ち破った。さらに、がん細胞においてはGTP 代謝リプログラムが起こり、高いGTP 濃度が維持されることで、細胞の同化反応が促進されること、またそれゆえ、GTP 代謝システム自体が、がん治療の標的になりうることも見出してきた^5-10）。これらはいずれもオリジナルな研究成果であり、解決すべき新たな謎が次々にでてきている。本稿ではGTP センサーの発見からみえてくる新たなGTP にまつわる生命機能—癌や代謝疾患、ストレス制御への関与—について、国や専門の壁を超えて学際的な研究を推し進める我々の取り組みとともに紹介する。 

2． GTP の役割

GTP はATP と同じプリン塩基を持つリボ核酸であり、エネルギー分子として様々な細胞機能を駆動するのも同じである。しかしながら、両者がエネルギー分子として働く局面には、明確な違いがある。ATP は細胞内のほぼ全ての代謝反応に関与しており、GTP の合成にも必要である。細胞のATP 濃度は常に高く、哺乳細胞では1-5 mM に保たれる。一方でGTP はタンパク質の合成や制御、細胞骨格の形成、膜輸送、シグナル伝達を駆動する役割を持っており、細胞のGTP濃度は、0.1-1 mMの濃度域で変動する。 

2.1 GTP 代謝異常と疾患
　GTP 合成に関わる幾つかの酵素には遺伝性疾患が報告されており、その表現型からGTP 代謝調節は生体において脳機能や視覚、免疫システムにおいて重要な役割を担っていることが知られている。また、GTP 代謝異常は痛風などの疾患とも関連する。例えば、サルベージ経路においてGTP 合成を担うHPRT1（Hypoxanthin-Phosphorybosyl transferase-1） に機能欠失型変異があると、部分欠失では高尿酸血症となり、重症の痛風や急性腎不全を引き起こす（Kelley-Seegmiller 症候群）。HPRT1 活性がほぼ完全に欠失すると自ら手指や口唇を噛む、頭を壁などに打ち付けるなどの自傷行為や、運動障害、認知機能障害を起こす（Lesch-Nyhan 症候群）^11-13）。新規（de novo）GTP 合成の律速酵素IMPDH（Inosine monophosphate dehydrogenase）のアイソザイム1 型（IMPDH1）の機能低下型変異は、網膜色素変性症を引き起こす（Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa およびLeber congenital amaurosis）^14,15）。これは、目の網膜がGTP濃度がとくに高い器官であることと関係している。網膜の視細胞は光刺激によりGTP をcGMP へ変換し、視神経への入力信号を惹起する。IMPDH1 は視細胞におけるGTP 維持に重要な役割を果たしており、その機能低下は網膜変性を引き起こし、視覚の老化を加速する結果、失明に至る^16）。また、IMPDH 阻害剤は、免疫抑制効果があり、臓器移植における拒絶反応の抑制や全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus: SLE）など自己免疫疾患の治療に用いられている^17,18）。これは免疫システムの作動に、GTP が重要な役割を担うことを示している。このようにGTP 代謝の破綻は、様々な生体機能の異常と病態をもたらす。

3. GTP 代謝の謎

3.1. 知識のギャップ① GTP 濃度変化とその制御
　歴史も深く、生命科学に携わる研究者なら誰でも知っている分子であるGTP、その構成因子であるグアニンは最初に発見された核酸塩基である（1844 年発見）。グアニンは農作物の収穫増産に重要な堆肥の成分でもあり、人類との関わりは紀元前500 年、インカ帝国まで遡る^9）。核酸の生合成経路は1940 年代から1950年代にかけて同定され(図1)、今に至るまでそのマップは基本的に変わっていない。一方、生体維持に重要な役割を持つGTP量は、組織や細胞種ごとに制御を受けており、GTP のATP に対する量比は大きく異なる (図2)^19）。一般に、増殖する細胞においては、GTP 濃度が顕著に増加する。これはバクテリアからヒトまで広く報告がある。この時、GTP の増加率は、ATP のそれを大きく上回る。しかし、生化学の教科書に記載のあるATP・GTP合成のフィードバック制御では、生体がGTP 濃度を独立に制御している事実を説明することが難しい。フィードバック制御では、ATP とGTP が互いの合成経路を促進させるため、GTP/ATP 比の大きな変化を原理的に生み出すことはできないためである。　GTP やATP の量の制御を考えるときには、それらがどのように消費されるのかも考える必要がある。GTP やATP は加水分解でGDP とADP などになるが、これらはリン酸化によりワンステップでGTP とATP に再生できる。一方、再生されにくい消費としては、RNA やDNA への組み込みがある。またGTP からBH₄（テトラヒドラビオプテリン）への変換や、ATP からCoA（コエンザイムA）, NAD⁺/NADH, NADP⁺/NADPH, SAM などへ変換も再生されにくい消費反応といえる。こうした消費反応の他にも、各種代謝酵素の発現量の変動や翻訳後修飾による活性制御などの要素が存在するため、細胞内におけるGTP・ATP 濃度の制御には未だ不明な点が多い。消費と合成の総和として決まる GTP・ATP濃度であるが、その制御機構は実はブラックボックスのままなのである。さらに複雑なことに、GTP 代謝は、エピジェネティックな変化や翻訳後修飾など非遺伝的な仕組みにより、制御を受けていることも考えられ、その破綻が先述の疾患に付随する病態とも関係していると考えられている。いずれにせよ、激しく増殖を行いGTP 消費量の多い細胞で、GTP 量が高く保たれている事実は、消費と合成がともに積極的な制御を受けていることを示している。

3.2. 知識のギャップ②　GTP 濃度の変動と機能
　GTP 濃度の変動が、細胞や生体の機能に変換される仕組みにも謎は多い。にもかかわらず、G タンパク質シグナルが広く知られているため、GTP 濃度変化の意義についても、多くのことが分かっているような気になりがちである。実際に、科学論文においてさえ、GTP濃度低下ではGタンパク質の「活性低下」が起こる結果、「○△□のような現象が惹起される」との考察が散見される。筆者のひとり佐々木も、そのように思い、GTP 濃度の低下で、癌原遺伝子として知られるG タンパク質RAS の活性が低下するだ ろうと思い実験を行った。しかし、この予想は見事に外れ、RASの活性はGTP 濃度を下げても変化しなかった（関連データは文献^8））。これは大きな驚きであった。実は、多くのG タンパク質はGTP やGDP に対し高い親和性を持ち、生理的なGTP 濃度の変動は機能に影響を与えない^20）。とすれば、実際には何がGTP濃度を、細胞機能に変換しているのであろうか? このような疑問に答えるべく、GTP-GEEKS の挑戦がはじまった。 

4. 細胞内GTP センサーの発見

4.1. 細胞内のセンサーシステム
　エンジンなどの内燃機関には、須く燃料ゲージが付いている。どのくらいのエネルギーが残っているのかが分からないと、エンジンが突然停止して路頭に迷う車が続出し、社会機能は麻痺するだろう。スマートフォンの電池残量がわからないと、多くの人は不安を覚え、社会活動にも制限がかかるに違いない。センサーは、システムを安定的に効率よく動かすために必須といえる。複雑なシステムである細胞にも様々なセンサーが存在する。細胞内の酸素濃度を感知するPDH-HIF システムは、低酸素時に転写リプログラムを誘導しミトコンドリアの酸化的リン酸化システムをダウンレギュレーションし、細胞の酸素消費を抑制することで、解糖系によるATP 再生や血管新生による酸素供給増加を促す。mTORシステムはアミノ酸や脂質など様々な栄養状態を感知して、細胞の同化作用や分解作用のバランスを制御する。AMPK は細胞のATP エネルギーの状態を感知して、mTOR と協働的に細胞機能を制御する。これらの代謝システムとセンサー分子の発見は、生命への理解を大きく深めただけでなく、センサー分子自体が、がんや代謝疾患などの治療開発標的として、世界中で熾烈な研究開発競争の対象になっている。その発見において、日本勢は黎明期に大いに健闘していたが、ある時期から後塵を拝している状況にある。

　GTP グループリーダーの一人佐々木敦朗は、留学先のハーバード大でG タンパク質のRAS を研究するなかで、GTP 変動の挙動がATP と違うことに強いギモンを覚えた。なぜGTP 濃度には大きな幅があるのか? 教科書にその答えはなく、論文も見つけられず、当時ポスドクとして在籍していたハーバード大の著名な研究者に聞くも回答は得られなかった。どうも、見落とされてきた大事なものがある。GTP 濃度を感知する仕組み（GTP センサー）や、未知のGTP エネルギー代謝システムがあるのではないだろうか? GTP 濃度変動が生み出す代謝シグナルは、生命のエネルギー利用に新たな自由度を与え、そのロバストネスの獲得につながったのではないだろうか? であるならば、その機能獲得は進化的にどのようになされてきたのだろうか?　佐々木は新たなGTP研究への道へ進むことを決意した。GTPセンサーがあるとすれば、

1）GTP に結合する性質
2）生理的なGTP 濃度への応答性
3）さらにGTP 濃度変化をシグナルに変換する機能

この3 つの条件を持つはずである。であれば、GTP に結合する分子をまずは同定してみよう（図3）。これが今のGTP 研究につながる第一歩となった。

　佐々木が釣り上げたGTP 結合性分子の中に、イノシトール脂質キナーゼPI5P4Kβがあった。PI5P4Kβは代謝やがんに重要との報告がある興味深い分子である 。PI5P4Kβのノックアウトマウスは、高脂肪食負荷による肥満抵抗性を示す一方でインシュリン感受性が増大する（例えるなら、毎日ハンバーガーやケーキをバクバク食べても太りにくく糖尿病にもなりにくい表現型） ^21）。PI5P4Kβとp53 のダブルノックアウトマウスは胎生致死となる^22）。細胞レベルでは、p53 変異のある乳がん細胞の増殖や腫瘍化に重要といった知見がある。メカニズムは不明な点が多いながら、こうしたsynthetic lethality（合成致死）はあたかもPI5P4Kβがp53 が担う機能を相補しているようにも見える。しかし、ATP を好むはずのキナーゼがなぜGTP に結合するのだろうか?PI5P4KβがGTP を使う生理的な意義は? 疾患とのつながりは? 大事な問いだが、これに答える術をもっておらず佐々木は壁にぶつかった。

　未踏のGTP バイオロジーを進めるためには、表現型の解析に加えて、それらを検証して理解することが必要である。分子レベルはもちろんのこと、原子レベルでのメカニズム解明が欠かせない。GTP センサーに関していえば、原子レベル、すなわちGTP認識の構造生物学的な理解が最低限必要である。立体構造情報に基づいてPI5P4KβのGTP に対する親和性を変化させた変異体や阻害剤などを開発することで、初めて細胞や個体でのGTP の役割、そしてGTP センサーの進化についての解析が可能になるだろう。ここに運命的ともいえる、NMR と創薬科学のエキスパート竹内恒 博士（現・東大院・薬系 教授）、X 線・クライオ電顕などを用いた構造解析をリードする千田俊哉 博士（現・KEK 教授・SBRC センター長）との出会いがあり、佐々木・竹内・千田をコアとしたGTP 研究のオタクたちの集うチーム、GTP-GEEKS が生まれた。

　PI5P4Kβはイノシトールリン脂質キナーゼ（PI キナーゼ）のファミリーメンバーであり、脂質セカンドメッセンジャーを制御する分子である。興味深いことに多くのキナーゼがATP をリン酸基供与体として使うのに対して、PI5P4KβはATP よりもGTP を好んで使うキナーゼであり、かつ細胞内のGTP 濃度変化に応じて活性を変化させるのに適したKm値（88 μM）を持っていた（図4）^1）。PI5P4Kβは高い濃度のATP が共存する条件（1~2 mM）においても、GTP を好んで使い、生理的濃度域でのGTP の増加によりキナーゼ活性が上昇する。これはGTP センサーに必須の性質である。このGTP への高い選択性を生み出すメカニズムを理解するため、PI5P4Kβの立体構造をX 線結晶解析により決定した。核酸が結合したPI5P4Kβの結晶構造を得るのは容易でなく、これを打破するため新しい手法の開発も行った^23）。
　こうして得られた結晶構造から、PI5P4Kβはそのキナーゼ触媒ポケットにおいて、ATP とGTP を異なるモードで結合することが明らかとなった。その中で、GTP 結合に重要な2 つのアミノ酸残基 Thr-201 およびPhe-205 が同定された（図5）。うちPhe-205 をLeu に置換変異（F205L 変異）を導入するとGTP 依存的なキナーゼ活性が減弱しATP 依存的なキナーゼ活性と同程度になった。一方で、ATP 依存的なキナーゼ活性は維持されていた。つまりF205L 変異はGTP 選択性のみを特異的に失わせる変異体といえる。F205L 変異体を用いることで、細胞や生体におけるPI5P4KβによるGTP 濃度感知機能がどのような役割を担っているのか解析していくことが可能となった^2）。
　PI5P4Kβはキナーゼ活性とは別にスキャフォールディング機能を有し、PI3K シグナルを負に制御していることが最近明らかとなっている^24）。このため、分子レベルでの過剰発現、ノックアウトやノックダウン（KD）といった標的分子の発現量を大きく変化させる方法では、得られた表現型の原因に関してGTP 濃度感知機能の生理作用とスキャフォールディング機能との間で明確に切り分けることができない。このように立体構造に基づいて、必要十分な変異導入により特定の機能にターゲットして変化を加える構造逆遺伝学的手法を、機能特異的KD アプローチと呼びたい^2）。F205L 変異体は、GTP 濃度感知機能の解明につながっただけでなく、GTP センサーへの機能的進化のメカニズムの解明にも大きな貢献をした^4,25）。