Calcium Kit II - Fura 2CS33 取扱説明書

Fura 2-AM は最も使用頻度の高い細胞内Ca²⁺ 測定試薬です。その蛍光特性は、カルシウムイオン濃度が高くなると340 nm 励起の蛍光強度が上昇し、380 nm 励起の蛍光強度が低下します。そのときの蛍光強度比(R=F_ex340nm/F_ex380nm) をとると、色素の濃度、光源の強度、細胞の大きさ等に関係なくカルシウムイオン濃度と対応づけることができます。
Calcium Kit II - Fura 2 は、細胞内Ca²⁺ 測定試薬である Fura 2-AM と、その測定に必要な Buffer 等を組み込んだキットです。細胞種や添加する薬剤などに応じて、Pluronic® F-127 またはCremophor® EL（Fura 2-AMの溶解補助剤）、Probenecid（陰イオントランスポーターの阻害剤）の各濃度を任意に設定でき、細胞を培養したマイクロプレートに直接添加できます。
細胞外に存在する Fura 2 の蛍光を消去する試薬が組み込まれていますので、従来のような細胞の洗浄操作が不要です。短時間で多くのサンプルを処理することができ、High Throughput Screening（HTS）に適しています。ただし、細胞種や添加する薬剤によっては、「レスポンスの高低」　「リガンドとの相互作用」などが生じることがあります。測定系に影響の少ない方法での測定を行いたい場合は、Wash タイプで姉妹品の「CalciumKit - Fura 2」をお薦めいたします。
本キットで調製した Loading Buffer で96 穴プレート10 枚分の測定が可能です。測定にはクリアボトムのプレートと下方励起・下方蛍光測定が可能なプレートリーダーをご使用下さい。

Fura 2-AM

Fluo 4-AM	50 μg x 10
Dimethylsulfoxide	2 ml x 1
Hanks’ HEPES Buffer (10X)	6 ml x 1
250 mmol/l Probenecid	1.3 ml x 1
5% Pluronic® F-127	2.5 ml x 1
5% Cremophor® EL	2.5 ml x 1
Quenching Buffer	55 ml x 1

冷凍にて保存してください。ご購入後、1 年以内にご使用ください。

• Loading Buffer は用時調製してください。
  • Loading Buffer は、長期保存すると、Fura 2-AM が分解する可能性があるので、出来るだけ1 回の操作で使い切ることをお薦めします。
• Quenching Buffer の容器への着色が見られる場合がありますが、ご使用には問題ありませんのでそのままお使いください｡
• Quenching Buffer 中に沈殿が生じる場合がありますが、品質には影響ありません。40℃ の水浴で加温溶解後お使いください。

• 本製品には、ガラス製容器を使用しております。保護手袋を着用するなど、お取扱に際してはご注意ください。

1. 細胞の培養

マイクロプレートの各ウェルに細胞浮遊液を分注し、炭酸ガスインキュベーター内で一晩培養する。

• 付着細胞を使用する際は、96 穴プレートでは 15,000 cells/well、384 穴プレートでは 5,000 cells/well 程度の細胞を一晩培養して使用することをお薦めします。
• 浮遊細胞を使用する際は、96 穴プレートでは 100,000 cells/well、384 穴プレートでは 25,000 cells/well 程度で使用することをお薦めします。
• 培養に用いる培地の量は、96 穴プレートで 100 μl/well、384 穴プレートで 25 μl/well をお薦めします。

 

2. Loading Buffer の調製 (96 穴マイクロプレート 1 枚分）

1. 添付の Dimethylsulfoxide から 50 μl を分取し、Fura 2-AM 1 本（50 μg）に加え、よく溶解する。
2. Quenching Buffer 5 ml に、Hanks’ HEPES Buffer (10X) 500 μl、測定条件に応じて、任意の量* の5% Pluronic® F-127（または5% Cremophor® EL）、250 mmol/l Probenecid を添加し、これに全量が10 ml となるように純水を加え、よく混合する（本キットは予め、測定に最適な pH7.4 付近となるよう構成してありますが、必要に応じて HCl や NaOH 溶液で pH を調整してください）。
3. Fura 2-AM の Dimethylsulfoxide 溶液 (50 μl) を添加して、よく混合溶解し、Loading Buffer とする。

• 推奨濃度を Probenecid: 1.25 mmol/l 、Pluronic® F-127: 0.04 % としてありますが、濃度の変更は可能です。

Loading Buffer 10 ml を調製する場合、Probenecid、Pluronic® F-127 ( またはCremophor® EL) のアッセイ時の最終濃度と、添加 の関係は下記のようになります。

 

3. 細胞への Fluo 4-AM のロード

1. 細胞を培養したままの状態で培地は取り除かない。直接、培地と当量（96 穴プレートで100 μl/well、384 穴プレートで25 μl/well) の Loading Buffer を、それぞれのウェルに加える。
2. 37°C で1 時間、インキュベートする。
3. そのまま薬剤添加による蛍光強度変化を各種蛍光プレートリーダーで測定する。
   (λ_ex = 340 nm / 380 nm, λ_em = 510 nm; 細胞洗浄の必要はありません。)