DAPGreen - Autophagy DetectionD676 取扱説明書

細胞内の不要なタンパク質や細胞小器官は、再利用または代謝するための分解過程が存在し、オートファジーと呼ばれています。この過程において、二重膜で構成される隔離膜は次第に伸長し、不要物を覆いオートファゴソームを形成します。内容物は、オートファゴソームとリソソームが融合したオートリソソームの段階で消化酵素により分解を受けます。この細胞機能はパーキンソン病などの神経変性疾患、老化に関りがあることが分かってきているため、ドラッグスクリーニングに対応した簡単なオートファジー検出手法が求められます。
低分子蛍光化合物のDAPGreen は、構造特性により形成過程のオートファゴソームに導入され二重膜構造の疎水環境に応答して蛍光発光します。そのため、本色素はautophagosome とautolysosome を検出します。低分子のため細胞への導入も容易であり、遺伝子導入などの必要はありません。本色素を細胞へ導入後は、蛍光顕微鏡下でのライブセルイメージングやフローサイトメトリーによる定量が可能です。尚、分解過程のオートリソソームのみを検出する場合は、DALGreen [D675] をお勧めします。

図 1 DAPGreen によるオートファジー検出

DAPGreen - Autophagy Detection

5 nmol x 1

 

遮光、-20°C にて保存してください。

• Dimethyl sulfoxide (DMSO)
• 培養培地
• HBSS またはフェノールレッド不含培地
• Micropipettes

0.1 mmol/l DAPGreen DMSO stock solution の調製

DAPGreen 5 nmol を含むチューブに50 μl のDMSO を加えピペッティングにより溶解する。

• 調製後は遮光、-20℃で保存してください。調製後1 か月間安定です。

DAPGreen working solution の調製

最終濃度が0.1-0.5 μmol/l になるようにDAPGreen DMSO stock solution を培養培地で希釈する。

• 細胞種により最適濃度が異なります。最適条件をご検討ください。

1. 細胞をディッシュに播種し培養する。
2. 培地を除去後、培養培地で1 回洗浄する。
3. 調製したDAPGreen working solution を添加し、37°C で30 分間インキュベートする。
4. 上澄みを除去後、培養培地で2 回洗浄する。
5. オートファジー誘導刺激剤を含む培地を加え37°C でインキュベートする。
   • オートファジー誘導条件に応じてインキュベート時間を設定して下さい。
6. 蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーにて測定する。

測定機器の種類	励起波長(nm)	蛍光波長(nm)
蛍光顕微鏡	425-475	500-560
フローサイトメトリー	488	500-560

共焦点レーザー顕微鏡による観察

μ-slide 8 well (Ibidi) にHeLa 細胞を播種し37°C、CO₂ インキュベーターにて一晩培養した。培養培地で1 回洗浄後、0.1 μmol/l DAPGreen working solution を添加し30 分インキュベートした。培養培地で2 回洗浄後、培養培地またはアミノ酸不含培地（和光純薬工業, 製品コード：048-33575）で5 時間培養した。HBSS で1 回洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

図2　DAPGreen 染色HeLa 細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像

DAPGreen で染色したHeLa 細胞を、
A) 栄養豊富な培地（培養培地）で5 時間培養した後の画像、
B) アミノ酸不含培地で5 時間培養した後の画像。
検出波長： 488 nm (Ex)、500- 563 nm (Em)
スケールバー： 20 μm

フローサイトメトリーによる検出

6 well プレートにHeLa 細胞を播種し37°C、CO₂ インキュベーターにて一晩培養した。培養培地で1 回洗浄後、0.1μmol/l DAPGreen working solution を添加し30 分インキュベートした。培養培地で2 回洗浄後、培養培地またはアミノ酸不含培地で3 時間培養した。PBS で1 回洗浄後、トリプシンで細胞を剥離し遠心にて細胞を回収した。HBSSに懸濁させ、フローサイトメトリーで測定した。

図3 フローサイトメトリーを用いた検出

DAPGreen 添加後、a) 培養培地で3 時間培養した細胞、b) アミノ酸不含培地で3 時間培養した細胞。

検出波長： 488 nm (Ex)、530/30 nm (Em)

DAPGreenの励起、蛍光スペクトル

1. H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu,and Y. Ueno, ‘’Small fl uorescent molecules for monitoring autophagic fl ux’’, FEBS Lett., 2018, 592, 559-567.