LysoPrime Deep Red - High Specificity and pH ResistanceL264 取扱説明書

リソソームは細胞内小器官の一つで生体膜に囲まれた酸性小胞であり、様々な分解酵素を内包しております。 リソソームは不要な物質を分解することで生体内恒常性の維持に寄与しています。リソソームの機能不全は神経変性疾患等の発症・進展に深く関与していることから、リソソームを詳細に解析することが病態の解明や治療薬の開発に有用であると考えられております。
リソソームの生細胞解析では低分子蛍光色素を用いたライブイメージングが汎用されてきましたが特異性やpH変化による染色能の低下が課題として挙げられてきました。本製品はよりリソソーム特異性が高くpH変化に抵抗性の低分子蛍光色素であり、より正確なリソソームの生細胞解析を可能とします。また、滞留性が高いため長期間のイメージングが必要な実験系にも適応可能です。

図1. LysoPrime Deep Redと従来の蛍光色素との違いについて

LysoPrime Deep Redの蛍光特性

λex: 656 nm λem: 682 nm ＜観察条件＞ Ex : 633 nm, Em : 640 – 700 nm

LysoPrime Deep Red

x 1 (35 mm dish 10枚分) x 3 (35 mm dish 30枚分)

遮光、-20 ℃にて保存してください。

• 培地
• Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) または無血清培地
• マイクロピペット
• マイクロチューブ

LysoPrime Deep Red DMSO stock solution の調製

LysoPrime Deep Redを含むチューブに 20 μlのDMSOを加え、ボルテックスミキサーにより溶解し、DMSO stock solutionを調製する。

• 調製後は-20℃で保存してください。調製後1ヶ月間安定です。

LysoPrime Deep Red working solution の調製

LysoPrime Deep Red DMSO stock solutionをHBSSまたは無血清培地で1,000 倍希釈し、LysoPrime Deep Red working solutionを調製する。

• 細胞種によって最適濃度が異なります。はじめてご使用される際には最適条件をご検討ください。
  (推奨希釈域: 1,000 – 5,000倍)
• 本色素は血清成分の影響を受けるため、血清不含培地またはHBSSで希釈してください。
• LysoPrime Deep Red working solutionは保存できません。調製したその日のうちにご使用ください

1. 細胞をディッシュに播種し、5% CO₂存在下、37 ℃で培養する。
2. 培地を取り除き、HBSSもしくは無血清培地を用いて2回洗浄する。
3. LysoPrime Deep Red working solutionを加え、5% CO₂存在下、37 ℃で30分インキュベートする。
4. 上澄みを取り除き、HBSSもしくは無血清培地を用いて2回洗浄する。
5. 培地を加え、蛍光顕微鏡で観察する。

共焦点蛍光顕微鏡を用いたリソソーム中pH変化の観察

1. μ-slide 8 well plate (ibidi社) にHeLa細胞（1.0 x 10⁴ cells/well）を播種し、5%CO₂存在下、37℃で一晩培養した。
2. HBSSで2回洗浄後、LysoPrime Deep Red working solution (1,000倍希釈)をwellに200 μl加え、37 ℃で30分インキュベートした。
3. 上澄みを取り除き、PBSで2回洗浄した。
4. HBSSで調製したBafilomycin A1 (Baf. A1:リソソーム酸性化阻害剤) を含んだpH依存性リソソーム染色色素(品コード: L265） pHLys Red working solution (1,000倍希釈) を wellに200 μl加え、37 ℃で30分インキュベートした。
5. 上澄みを取り除き、細胞をHBSSで2回洗浄した。
6. 新しい10% FBS含有MEM培地をwellに200 μl加え、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。

図2.　Bafilomycin A1によるリソソームpHへの影響

CTRL: 通常培養条件、Baf. A1: リソソーム酸性化阻害条件 (50 nmol/l) LysoPrime Deep Red 検出波長 : 633 nm (Ex), 640 – 700 nm (Em) pHLys Red 検出波長 : 561 nm (Ex), 560 – 650 nm (Em)