Biotin Labeling Kit - NH2LK03 取扱説明書

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はじめに

Biotin Labeling Kit - NH2は、アミノ基を有するタンパク質、特に抗体へビオチンを標識するためのキットです。キット付属のNH2-Reactive Biotinは、その分子内に活性エステル基を有しているため、アミノ基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。標識反応を阻害するような低分子化合物（トリスやグリシンなど）や未反応のNH2-Reactive Biotinは付属のFiltration Tubeを用いて容易に除去することができます。
本キットには、DMSOを除く標識に必要な試薬と作製したビオチン標識体を保存するための溶液が含まれています。

キット内容

NH2-Reactive Biotin 3 tubes
WS Buffer 4 ml x 1
Reaction Buffer 500 μl x 1
Filtration Tube 3 tubes

保存条件

0～5℃で保存してください。ご購入後、未開封の状態で1年間安定です。

注意

NH2-Reactive Biotinは、アルミラミジップに３本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のNH2-Reactive Biotinは、アルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20℃で保存してください。
NH2-Reactive Biotin以外は、0～5℃で保存してください。

必要なもの (キット以外)

  • 10 μl, 200 μl マイクロピペッタ－
  • インキュベーター（37℃）
  • DMSO
  • 遠心機（マイクロチューブ用）
  • マイクロチューブ（標識体保存用）

使用上の注意

  • 分子量が50,000以上で、反応性のアミノ基を有するサンプルへ標識することができます。
  • 試料溶液中に標識対象以外の分子量10,000以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。
    あらかじめ試料溶液を精製して、ご使用ください。
  • 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
  • 冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、Filtration Tubeに水適様の液粒が見られることがあります。これはメンブランの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。

プロトコール


操作1.
WS Buffer 100 μlとタンパク質50~200 μgを含む試料溶液a)をFiltration Tubeに加える。
操作2.
ピペッティングにより軽く混合した後、8,000 x gで10分間遠心するb)。

操作3.
NH2-Reactive Biotinに10 μlのDMSOを加え、ピペッティングにより溶解するc) 。
操作4.
Filtration Tubeのメンブレン上にReaction Buffer 100 μlを加えた後、NH2-Reactive Biotinを含むDMSO溶液8 μld) を加える。

操作5.
ピペッティングによりメンブレン上のタンパク質とよく混合した後、37°Cで10分間反応する。
操作 6.
WS Buffer 100 μlをFiltration Tubeに入れ、8,000 x gで10分間遠心するb)。遠心後、ろ液を捨てる。

操作7.
WS Buffer 200 μlをFiltration Tubeに入れ、8,000 x gで10分間遠心するb)。この操作を再度繰り返す。
操作8.
WS Buffer 200 μlをFiltration Tubeに入れ、10回程度ピペッティングし、標識体を回収する。マイクロチューブに移し、0～5°Cで保存するe)。

a) 液量は100 μl以下でご使用ください。タンパク質濃度が0.5 mg/ml 以下の場合には、操作1と2を繰り返してタンパク質量が50～200 μgとなるように濃縮してください。

b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに8,000 x gで5分間遠心してください。

c) NH2-Reactive Biotinはチューブの底に入っています。DMSOを加える際はチューブの底に入れ、軽くピペッティングして溶解させてください。また、NH2-Reactive BiotinはDMSO中の水分により加水分解しやすいので、DMSOに溶解後は直ちに操作4へ進んでください。

d) タンパク質 200 μgに標識する場合、NH2-Reactive Biotin DMSO溶液は10 μl全量を加えてください。

e) 標識体を回収する際はWS Bufferを使うことを推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

標識反応

Q & A

このキットを使って、どのようなタンパク質にビオチンを標識することができますか？

分子量が50,000以上で、反応性のアミノ基を有していれば標識できます。

市販の抗体を用いて標識できますか？

標識できます。ただし、安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害される場合があります。このような抗体をご使用の場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどにより精製してご使用ください。精製法についてご不明な点がございましたらご相談ください。

ビオチン標識体はどのくらい安定ですか？

標識体の安定性はタンパク質自身の安定性に依存しますが、本キットを用いてrabbit IgGにビオチン標識した場合、4℃で2ヶ月は安定であることを確認しております。ただし、長期保存する場合には等量のグリセロールを添加して、-20℃で保存してください。

タンパク質 1分子当たりにビオチンはいくつ導入できますか？

ビオチン導入数はタンパク質中の反応性のアミノ基の数に依存します。 rabbit IgGの場合、1分子あたり7～10個導入されます。

使用できるタンパク質が少量しかないのですが？

本キットはタンパク質量50～200 μgでのご使用を推奨しておりますが、10 μgでも標識は可能です。ただし、10 μgのタンパク質を標識する場合は50～200 μgの場合と比較して、バックグラウンドの上昇などの問題が生じる可能性があります。

このキットを使ってタンパク質以外のオリゴヌクレオチドやペプチドにビオチンをラベル化することはできますか？

オリゴヌクレオチドやペプチドは、Filtration Tubeのメンブレンフィルター孔より分子量が小さく、メンブレンフィルター上に保持することができないため、ラベル化することはできません。

本キットと弊社製品 BK01 Biotinylation Kit(Sulfo-OSu)との違いは？

推奨する標識タンパク質の量が異なります。Biotinylation Kit(Sulfo-OSu)は1～5 mgのタンパク質のビオチン化と精製が可能ですが、本キットは50～200 μgとBiotinylation Kit(Sulfo-OSu)に比べて、より少量のタンパク質のビオチンラベル化に適しています。

ビオチン標識したタンパクを生細胞へ添加したいのですが、注意点はありますか？

細胞状態をより安定に保つため、生細胞懸濁液を調製する際は、2～10% FBSを含むPBSを用いることをお勧めします。

標識体を回収するWS Bufferは、生細胞へ影響しませんか？

WS Buffer中には、細胞毒性を殆ど示さない量の安定化剤(界面活性剤)を含んでいます。細胞への影響が気になる場合は、別途任意のbufferを用いて標識体を回収してください。

LK03: Biotin Labeling Kit - NH2
Revised Jan., 05, 2024