Peroxidase Labeling Kit - SHLK09 取扱説明書

Peroxidase Labeling Kit - SH は、SH 基を有する分子にペルオキシダーゼを標識するためのキットです。SH-Reactive Peroxidase は、マレイミド基を導入したペルオキシダーゼです。SH 基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。標的タンパク質が SH 基を持っていない場合、付属の還元剤を用いて遊離 SH 基 を調製することが可能です ( ただし、S-S 結合の切断によってタンパク質の活性が失われる場合があります )。低分子化合物にペルオキシダーゼを標識する場合には、未反応の低分子化合物は付属の Filtration Tube を用いて容易に除去することができます。また、IgG のような高分子タンパクにペルオキシダｰゼを標識する場合、ペルオキシダーゼ活性を阻害するような低分子化合物（アジ化ナトリウムなど）は、Filtration Tube を用いた前処理によって除去されます。本キットには標識に必要なすべての試薬と作製した標識体を保存するための溶液が含まれています。

SH-Reactive Peroxidase	3 tubes
Reducing Agent	3 tubes
Solution A	4 ml x 1
Solution B	1 ml x 1
Reaction Buffer	200 μl x 1
Storage Buffer	4 ml x 1
Filtraion Tube	3 tubes

0 ～ 5℃で保存してください。ご購入後、未開封の状態で 1 年間安定です。

 

注意 SH-Reactive Peroxidase は、アルミラミジップに３本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用の SH-Reactive Peroxidase は、アルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20℃で保存してください。SH-Reactive Peroxidase 以外は、0 ～ 5℃で保存してください。

• 以下のサンプルへ標識することができます。

  SH 基を有するタンパク質	( 分子量 50,000 以上 ; 標識タンパク量 : 50 〜 200 μg)
  SH 基を有する低分子化合物	( 分子量 5,000 以下 )

• 試料溶液中に標識対象以外の分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。 あらかじめ試料溶液を精製して、ご使用ください。
• Reducing Agent は、IgG への標識用として最適化されています。IgG 以外の S-S 結合を有するサンプルをご使用になる場合は、S-S 結合の切断によって標識対象分子の活性が失われる場合がありますので、検討が必要です。
• 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
• 冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、Filtration Tube に水適様の液粒が見られることがあります。これはメンブランの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。
• 本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれています。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので、 開封前に振り落としてからご使用ください。

SH 基を有する低分子化合物（分子量 5,000 以下）への標識

 

a) サンプルが溶液の場合、10 mmol/l サンプル溶液 5 μl と Reaction Buffer 45 μl を混合し、1 mmol/l サンプル溶液を調製てください。サンプルが Reaction Buffer に溶解しない場合、DMSO を用いて 10 mmol/l のサンプル溶液を調製し、この溶液 5 μl と Reaction Buffer 45 μl を混合し、 1 mmol/l サンプル溶液としてください。サンプル以外に SH 基を有する物質が含まれる場合には取り除いてください。

b) 溶液がメンブレン上に残っている場合には、さらに 8,000 × g で 5 分間遠心してください。

c) ペルオキシダーゼ 1 分子に対し、1 ～ 2 分子の低分子化合物が標識されます。

d) 標識体を回収する際は Storage Buffer のご使用を推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

Immunoglobulin (IgG) への標識 ^a)

 

a) SH 基を有するサンプルの場合、還元操作 (操作 3 ～ 6) を省略できます。

b) 液量は 100 μl 以下でご使用ください。IgG 濃度が 0.5 mg/ml 以下の場合には、操作 1 と 2 を繰り返して IgG 量が 50 ～ 200 μg となるように濃縮してください。

c) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに 8,000 × g で 5 分間遠心してください。

d) Reducing Agent がキャップの内側に付着している場合があります。開封にはご注意ください。

e) Reducing Agent による還元反応では、IgG のヒンジ部分以外も還元される場合があります。

f) SH-Reactive Peroxidase は Reaction Buffer 中で不安定です。Reaction Buffer に溶解後は直ちに操作 8 へ進んでください。

g) 2～4分子のペルオキシダーゼがIgG 1分子に標識されます。未反応のペルオキシダーゼは通常のイムノアッセイには影響を及ぼしません。 希釈してご使用ください。精製が必要な場合には、ゲルろ過カラムあるいは IgG のアフィニティーカラムにより精製を行ってください。

h) 標識体を回収する際は Storage Buffer のご使用を推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

市販の抗体を用いて標識できますか？

標識できます。ただし、安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害される場合があります。このような抗体をご使用の場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどにより精製してご使用ください。精製法について、ご不明な点がございましたらお問い合わせください。

このキットを使って抗体以外のタンパク質にペルオキシダーゼを標識することはできますか？

分子量が 5,000 以下あるいは 50,000 以上で、SH 基あるいは還元操作によって活性を失わないジスルフィド基があれば標識できます。分子量が 50,000 以上の場合には「IgG への標識」のプロトコールに従ってください。分子量が 5,000 以下の場合 には「SH 基を有する低分子化合物への標識」のプロトコールに従ってください。分子量が 5,000 以上 50,000 以下の場合にはお問い合わせください。

ペルオキシダーゼ標識体はどのくらい安定ですか？

標識体の安定性はタンパク質自身の安定性に依存しますが、本キットを用いて goat IgG に標識した場合、 4°Cで 2 ヶ月は安定であることを確認しています。長期保存する場合には等量のグリセロールを添加して、 -20°Cで保存してください。

このキットを使ってオリゴヌクレオチドやペプチドにペルオキシダーゼを標識することはできますか？

分子量が 5,000 以下で、SH 基があれば標識できます。「 低分子化合物への標識 」のプロトコールに従ってください。

使用できる IgG が少量しかないのですが…。

本キットは、タンパク質量 50 ～ 200 μg でのご使用を推奨しておりますが、10 μg でも標識は可能です。ただし、10 μg のタンパク質を標識する場合、その後のアッセイでバックグランドの上昇などの問題が生じる可能性があります。