Peroxidase Labeling Kit - NH2LK11 取扱説明書

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はじめに

Peroxidase Labeling Kit - NH2は、アミノ基を有する分子にペルオキシダーゼを標識するためのキットです。NH2-Reactive Peroxidaseは、活性エステル基を導入したペルオキシダーゼです。アミノ基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。低分子化合物にペルオキシダーゼを標識する場合、未反応の低分子化合物は付属のFiltration Tubeを用いて容易に除去することができます。また、IgGのような高分子タンパクにペルオキシダーゼを標識する場合、ペルオキシダーゼ活性や標識反応を阻害するような低分子化合物（アジ化ナトリウムやトリスなど）は、Filtration Tubeを用いた前処理によって除去されます。本キットには標識に必要なすべての試薬と作製した標識体を保存するための溶液が含まれています。

キット内容

NH2-Reactive Peroxidase 3 tubes
Reaction Buffer 200 μl x 1
Washing Buffer 4 ml x 1
Storage Buffer 4 ml x 1
Filtration Tube 3 tubes

保存条件

0～5℃で保存してください。ご購入後、未開封の状態で1年間安定です。

ご注意

NH2-Reactive Peroxidaseは、アルミラミジップに３本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のNH2-Reactive Peroxidaseは、アルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20℃で保存してください。NH2-Reactive Peroxidase以外は、0～5℃で保存してください。

必要なもの (キット以外)

  • 10 μl, 200 μl マイクロピペッタ－
  • インキュベーター（37°C）
  • 遠心機（マイクロチューブ用）
  • マイクロチューブ（標識体保存用）

使用上の注意

  • 以下のサンプルへ標識することができます。
    ・アミノ基を有するタンパク質 (分子量 50,000以上; 標識タンパク量 : 50〜200 μg)
    ・アミノ基を有する低分子化合物 (分子量 5,000以下)
  • 試料溶液中に標識対象以外の分子量10,000以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。
    あらかじめ試料溶液を精製して、ご使用ください。
  • 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
  • 冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、Filtration Tubeに水適様の液粒が見られることがあります。これはメンブランの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。
  • 本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれています。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので、 開封前に振り落としてからご使用ください。

プロトコール 1

Immunoglobulin(IgG)への標識


操作 1.
IgG 50～200 μgを含むサンプル溶液a) とWashing Buffer 100 μlをFiltration Tubeに加える。
操作 2.
ピペッティングにより軽く混合した後、8,000 x gで10分間遠心するb)。

操作 3.
Washing Buffer 100 μlをFiltration Tubeに加える。
操作 4.
8,000 x gで10分間遠心するb)。

操作 5.
Reaction Buffer 10 μlをNH2-Reactive Peroxidaseに加え、ピペッティングにより溶解するc)。
操作 6.
NH2-Reactive Peroxidaseを含む溶液をIgGが濃縮されているFiltration Tubeのメンブレン上に加える。

操作 7.
ピペッティングによりメンブレン上のIgGとよく混合した後、37°Cで2時間反応する。
操作 8.
Washing Buffer 100 μlをFiltration Tubeに加える。

操作 9.
8,000 x gで10分間遠心するb)。
操作 10.
Storage Buffer 200μlを加えて、10回程度ピペッティングし、標識体を回収するd)。マイクロチューブに移し、0～5℃で保存するe)。

a) 液量は100 μl以下でご使用ください。IgG濃度が0.5 mg/ml 以下の場合には、操作1と2を繰り返してIgG量が50～200 μgとなるように濃縮してください。

b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに8,000 × gで5分間遠心してください。

c) NH2-Reactive PeroxidaseはReaction Buffer中で不安定です。Reaction Bufferに溶解後は直ちに操作6へ進んでください。

d) 1～3分子のペルオキシダーゼがIgG 1分子に標識されます。未反応のペルオキシダーゼは通常のイムノアッセイには影響を及ぼしません。希釈してご使用ください。精製が必要な場合には、ゲルろ過カラムあるいはIgGのアフィニティーカラムにより精製を行ってください。

e) 標識体を回収する際はStorage Bufferのご使用を推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

プロトコール 2

アミノ基を有する低分子化合物（分子量5,000以下）への標識


操作 1.
Reaction Bufferで調製した1 mmol/l サンプル溶液 50 μl を、NH2-Reactive Peroxidaseに加える。
操作 2.
ピペッティングによりNH2-Reactive Peroxidaseを溶解した後、37°Cで1時間反応する。

操作 3.
Washing Buffer 100 μlを反応溶液に加え、この溶液をFiltration Tubeに移す。
操作 4.
8,000 × gで10分間遠心するb)。

操作 5.
ろ液を捨てた後、Washing Buffer 200 μlを加える。
操作 6.
8,000 × gで10分間遠心するb)。
再度、Washing Buffer 200 μlを加えて、8,000 × gで10分間遠心するb)。

操作 7.
Storage Buffer 200 μlを加えて、10回程度ピペッティングし、標識体を回収するd)。マイクロチューブに移し、0～5°Cで保存する。		  

a) サンプルがReaction Bufferに溶解しない場合、DMSOを用いて10 mmol/lのサンプル溶液を調製し、この溶液5 μlとReaction Buffer 45 μlを混合し、1 mmol/l サンプル溶液としてください。サンプル以外にアミノ基を有する物質（トリスやグリシンなど）が含まれる場合には取り除いてください。

b) 溶液がメンブレン上に残っている場合には、さらに8,000 × gで5分間遠心してください。

c) ペルオキシダーゼ1分子に対し、1～2分子の低分子化合物が標識されます。

d) 標識体を回収する際は、Storage Bufferのご使用を推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

Q & A

市販の抗体を用いて標識できますか？

標識できます。ただし、安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害される場合があります。このような抗体をご使用の場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどにより精製してご使用ください。精製法について、ご不明な点がございましたらお問い合わせください。

ペルオキシダーゼ標識体はどのくらい安定ですか？

標識体の安定性はタンパク質自身の安定性に依存しますが、本キットを用いてgoat IgGに標識した場合、4°Cで2ヶ月間安定であることを確認しています。長期保存する場合には、等量のグリセロールを添加して、-20°Cで保存してください。

このキットを使ってIgG以外のタンパク質にペルオキシダーゼを標識することができますか？

分子量が50,000以上あるいは5,000以下で、反応性のアミノ基を持っていれば標識できます。分子量が50,000以上である場合、-IgGへの標識- のプロトコールに従って、50～200 μgのサンプルをご使用ください。分子量が5,000以下の場合には、-低分子化合物への標識-のプロトコールに従ってください。分子量が5,000以上50,000以下の場合は、お問い合わせください。

このキットを使ってタンパク質以外のオリゴヌクレオチドやペプチドにペルオキシダーゼを標識することができますか？

分子量が5,000以下で、反応性のアミノ基を持っていれば標識できます。-低分子化合物への標識-のプロトコールに従ってください。

使用できるIgGが少量しかないのですが…。

本キットは、タンパク質量 50～200 μgでのご使用を推奨しておりますが、10 μgでも標識は可能です。ただし、10 μgのタンパク質を標識する場合は50～200 μgの場合と比較して、バックグランドの上昇などの問題が生じる可能性があります。

NH2-Reactive Peroxidaseは標識反応の間にオリゴマーを形成しますか？

NH2-Reactive Peroxidaseのアミノ基はすべて保護されていますので、オリゴマーは形成されません。

LK11: Peroxidase Labeling Kit - NH2
Revised Dec., 05, 2023