HiLyte Fluor 647 Labeling Kit - NH2LK15 取扱説明書

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はじめに

HiLyte FluorTM 647 Labeling Kit - NH2は、アミノ基を有するタンパク質、特に抗体へHiLyte FluorTM 647色素を標識するためのキットです。HiLyte FluorTM 色素は米国AnaSpec社が開発した蛍光色素です。キット付属のNH2-Reactive HiLyte FluorTM 647は、その分子内に活性エステル基を有しているため、アミノ基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。タンパク質にHiLyte FluorTM 647を標識する場合、標識反応を阻害するような低分子化合物（トリスなど）や未反応のNH2-Reactive HiLyte FluorTM 647は付属のFiltration Tubeを用いて容易に除去することができます。HiLyte FluorTM 647標識IgGの場合、蛍光波長はλex/em＝655/670 nmです。本キットには、標識に必要な試薬と作製したHiLyte FluorTM 647標識体を保存するための溶液が含まれています。

キット内容

NH2-Reactive HiLyte FluorTM 647 3 tubes
WS Buffer 4 ml×1
Reaction Buffer 500 μl×1
Filtration Tube 3 tubes

保存条件

0～5°Cで保存してください。ご購入後、未開封の状態で1年間安定です。

ご注意

NH2-Reactive HiLyte FluorTM 647は、アルミラミジップに3本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のNH2-Reactive HiLyte FluorTM 647は、アルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20℃で保存してください。NH2-Reactive HiLyte FluorTM 647以外は、0～5℃で保存してください。

必要なもの (キット以外)

  • 10 μl, 200 μl マイクロピペッタ－
  • インキュベーター（37℃）
  • DMSO
  • 遠心機（マイクロチューブ用）
  • マイクロチューブ（標識体保存用）

使用上の注意

  • 分子量が50,000以上で、反応性のアミノ基を有するサンプルへ標識することができます。
  • 試料溶液中に標識対象以外の分子量10,000以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。 あらかじめ試料溶液を精製して、ご使用ください。
  • 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
  • 冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、Filtration Tubeに水適様の液粒が見られることがあります。これはメンブランの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。

プロトコール


操作 1.
タンパク質 50~200 μgを含むサンプル溶液とWS Buffer 100 μlをFiltration Tubeに入れ、ピペッティングにより軽く混合するa)。
操作 2.
8,000 x gで10分間遠心するb)。

操作 3.
NH2-Reactive HiLyte Fluor™ 647に10 μlのDMSOを加え、ピペッティングにより溶解するc)。
操作 4.
Filtration Tubeのメンブレン上にReaction Buffer 100μlを加えた後、NH2-Reactive HiLyte Fluor™ 647を含むDMSO溶液 8 μl d)を加える。

操作 5.
ピペッティングによりメンブレン上のタンパク質と混合した後、37°Cで10分間反応させる。
操作 6.
WS Buffer 100 μl をFiltration Tubeに入れ、8,000 x gで10分間遠心するb)。遠心後、ろ液を捨てる。

操作 7.
WS Buffer 200 μlをFiltration Tubeに入れ、8,000 x gで10分間遠心するb)。 この操作をもう一度繰り返す。
操作 8.
WS Buffer 200 μlをFiltration Tubeに入れ、10回程度ピペッティングし、標識体を回収するe)。マイクロチューブに移し、0～5℃で保存する。

a) 100 μl 以下の液量を使用してください。タンパク質濃度が0.5 mg/ml未満である場合は、操作1と2を繰り返し、タンパク質量が50～200 μgとなるようにしてください。

b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに5分間遠心してください。

c) NH2-Reactive HiLyte Fluor™ 647はチューブの底に入っています。DMSOを加える際はチューブの底に入れ、軽くピペッティングして溶解させてください。また、NH2-Reactive HiLyte Fluor™ 647はDMSO中の水分により加水分解しやすいので、DMSOに溶解後は直ちに操作4へ進んでください。

d) タンパク質 200 μgに標識する場合、NH2-Reactive HiLyte Fluor™ 647 溶液は10 μl 全量を加えてください。

e) 標識体を回収する際はWS Bufferを使うことを推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。またFiltration Tubeのメンブレンが未反応の色素によって着色されることがありますが、WS Bufferで十分にピペッティングすれば、標識体は90%以上回収されています。

標識率の決定

タンパク質1分子あたりに標識されたHiLyte FluorTM 647の数（標識率）を算出したい場合はHiLyte FluorTM 647標識タンパク質溶液を中性の緩衝液で希釈して280 nm, 655 nmの吸光度を測定してください。標識率は次式で計算できます。IgGの場合はεとして216,000を使用してください。HiLyte FluorTM 647のWS Buffer中でのモル吸光係数は250,000です。

標識率（HiLyte Fluor™ 647 / タンパク質比）= A655 / 250,000 (A280 - A655 x 0.05) / (ε of protein)

A655: 655 nmの吸光度
A280: 280 nmの吸光度
ε : タンパク質の 280 nmでのモル吸光係数

標識反応

Q & A

市販の抗体を用いて標識できますか？

標識できます。ただし、安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害されます。このような抗体をご使用の場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどにより精製してご使用ください。精製方法につきまして御不明な点がございましたらお問い合わせください。

タンパク質１分子あたりにHiLyte FluorTM 647はいくつ導入できますか？

導入数はタンパク質中の反応性のアミノ基の数に依存します。rabbit IgGの場合、1分子あたり3個から7個導入されます。

HiLyte FluorTM 647標識体はどのくらい安定ですか？

標識体の安定性はタンパク質自身の安定性に依存しますが、本キットを用いてrabbit IgGに標識した場合、4 ℃で2ヶ月は安定であることを確認しています。長期保存する場合には等量のグリセロールを添加して、-20 ℃で保存してください。

使用できるタンパク質が少量しかないのですが･･･

本キットはタンパク質量50～200 μgでのご使用を推奨しておりますが、10 μgでも標識は可能です。ただし、10 μgのタンパク質を標識する場合、その後のアッセイでバックグラウンドの上昇などの問題が生じる可能性があります。

このキットを使ってタンパク質以外のオリゴヌクレオチドやペプチドにHiLyte FluorTM 647をラベル化することはできますか？

オリゴヌクレオチドやペプチドは、Filtration Tubeのメンブレンフィルター孔より分子量が小さく、メンブレンフィルター上に保持することができないため、ラベル化することはできません。

蛍光標識したタンパク質を生細胞へ添加したいのですが、注意点はありますか？

細胞状態をより安定に保つため、生細胞懸濁液を調製する際は、2-10% FBSを含むPBSを用いることをお勧めします。

標識体を回収するWS Bufferは、生細胞へ影響しませんか？

WS Buffer中には、細胞毒性を殆ど示さない量の安定化剤(界面活性剤)を含んでいます。もし細胞への影響が気になる場合は、別途任意のバッファーを用いて標識体を回収してください。

 

LK15: HiLyte Fluor 647 Labeling Kit - NH2
Revised Nov., 27, 2023