Allophycocyanin Labeling Kit - NH2LK21 取扱説明書

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はじめに

Allophycocyanin Labeling Kit - NH2は、アミノ基を有する高分子( 抗体など) にアロフィコシアニンを標識するためのキットです。NH2-Reactive Allophycocyanin は、その構造内に活性エステル基を有しているため、アミノ基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。標識反応を阻害するような低分子化合物（トリスやグリシンなど）は付属のFiltration Tube を用いた前処理によって除去されます。本キットには、標識に必要なすべての試薬と作製したアロフィコシアニン標識体を保存するための溶液が含まれています。

キット内容

NH2-Reactive Allophycocyanin 3 tubes
WS Buffer 4 ml x 1
Reaction Buffer 200 μl x 1
Filtration Tube 3 tubes

保存条件

0 ～ 5°Cで保存してください。ご購入後、未開封の状態で1 年間安定です。

ご注意

NH2-Reactive Allophycocyanin はアルミラミジップに３本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のNH2-Reactive Allophycocyanin はアルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20°Cで保存してください。NH2-Reactive Allophycocyanin 以外は、0 ～ 5°Cで保存してください。

必要なもの ( キット以外）

  • 10 μl, 200 μl マイクロピペッタ－
  • インキュベーター（37℃）
  • 遠心機（マイクロチューブ用）
  • マイクロチューブ（標識体保存用）

使用上のご注意

  • 分子量が50,000 以上で、反応性のアミノ基を有するサンプルへ標識することができます。
  • 試料溶液中に標識対象以外の分子量10,000 以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。あらかじめ試料溶液を精製してご使用ください。
  • 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
  • 冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、Filtration Tube に水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブランの乾燥抑制剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。
  • 本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれています。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので、 開封前に振り落としてからご使用ください。

Allophycocyanin 標識タンパク質の励起・蛍光スペクトル

最大励起波長：650 nm
最大蛍光波長：660 nm

プロトコール

Immunoglobulin (IgG)への標識


操作 1.
IgG 50 ～ 200 μg を含む試料溶液a) とWS Buffer 100 μl をFiltrationTube に加える。
操作 2.
ピペッティングにより軽く混合した後、8,000 x gで10 分間遠心するb)。

操作 3.
WS Buffer 100 μl をFiltration Tube に加える。
操作 4.
8,000 x gで10分間遠心するb)。

操作 5.
Reaction Buffer 10 μl をNH2-Reactive Allophycocyanin に加え、ピペッティングにより溶解するc)。
操作 6.
NH2-Reactive Allophyco-cyaninを含む溶液をIgG が濃縮されているFiltration Tube のメンブレン上に加える。

操作 7.
ピペッティングによりメンブレン上のIgG とよく混合した後、37°Cで2 時間反応する。
操作 8.
WS Buffer 190 μl を加えて、10回程度ピペッティングし、標識体を回収するd)。マイクロチューブに移し、0 ～ 5°Cで保存するe)。

a) 液量は100 μl 以下でご使用ください。IgG 濃度が0.5 mg/ml 以下の場合には、操作 1.と 2.を繰り返してIgG 量が50～ 200 μg となるように濃縮してください。

b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに8,000 x g で5 分間遠心してください。

c) NH2-Reactive Allophycocyanin は水分により加水分解しやすいので、Reaction Buffer に溶解後は直ちに操作 6. へ進んでください。

d) 1 ～ 2 分子のアロフィコシアニンがIgG1 分子に標識されます。また、回収した標識体には未反応のアロフィコシアニンが残るので、イムノアッセイにおいてバックグラウンドへの影響が考えられます。バックグラウンドを低減する必要がある場合は、ゲルろ過カラムやアフィニティーカラムなどにより精製を行ってください。

e) 標識体を回収する際は、WS Buffer のご使用を推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

Q & A

市販の抗体を用いて標識できますか？

標識できます。ただし、安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害される場合があります。このような抗体をご使用の場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどにより精製してご使用ください。精製法についてご不明な点がございましたらご相談ください。

使用できるタンパク質が少量しかないのですが･･･

本キットはタンパク質量50 ～ 200 μg でのご使用を推奨しておりますが、10 μg でも標識は可能です。ただし、10 μg のタンパク質を標識する場合は50 ～ 200 μg の場合と比較して、バックグラウンドの上昇などの問題が生じる可能性があります。

NH2-Reactive Allophycocyanin は標識反応の間にオリゴマーを形成しますか？

NH2-Reactive Allophycocyanin のアミノ基は全て保護されていますので、オリゴマーは形成されません。

アロフィコシアニン標識体はどのくらい安定ですか？

標識体の安定性はタンパク質自身の安定性に依存します。長期保存する場合には標識体溶液に等量のグリセロールを加え、-20℃で保存してください。

保存していた標識体が沈殿を生じましたが、使用できますか？

沈殿が生じた場合は、標識体を遠心分離(10,000 x g‚ 10 分間) し、上清をご使用ください。

蛍光標識したタンパク質を生細胞へ添加したいのですが、注意点はありますか？

細胞状態をより安定に保つため、生細胞懸濁液を調製する際は、2-10% FBS を含むPBS を用いることをお勧めします。

標識体を回収するWS Buffer は、生細胞へ影響しませんか？

WS Buffer 中には、細胞毒性を殆ど示さない量の安定化剤( 界面活性剤) を含んでいます。もし細胞への影響が気になる場合は、別途任意のバッファーを用いて標識体を回収してください。

LK21: Allophycocyanin Labeling Kit - NH2
Revised Nov., 28, 2023