R-Phycoerythrin Labeling Kit - SH LK26 取扱説明書

はじめに

R-Phycoerythrin Labeling Kit-SHは、SH 基を有する高分子(抗体など)にR-フィコエリスリンを標識するためのキットです。SH-Reactive R-Phycoerythrinは、その構造内にマレイミド基を有しているため、SH 基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。標的分子がSH 基を有しておらず、分子内にS-S 結合を有している場合には、付属の還元剤を用いて遊離SH 基を調製することが可能です。本キットには、標識に必要なすべての試薬と作製したR- フィコエリスリン標識体を保存するための溶液が含まれています。

キット内容

SH-Reactive R-Phycoerythrin	3 tubes
RA Solution	1 ml x 1
WS Buffer	4 ml x 1

Reducing Agent	3 tubes
Reaction Buffer	200 μl x 1
Filtraion Tube	3 tubes

保存条件

0～5°Cで保存してください。ご購入後、未開封の状態で1 年間安定です。

ご注意

SH-Reactive R-Phycoerythrinは、アルミラミジップに3本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のSH-Reactive R-Phycoerythrinは、アルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20℃で保存してください。SH-Reactive R-Phycoerythrin 以外は、0～5℃で保存してください。

必要なもの（キット以外）

200 μl マイクロピペッター
インキュベーター(37℃)
遠心機(マイクロチューブ用)
マイクロチューブ(標識体保存用)

使用上の注意

分子量が50,000以上で、S-S結合またはSH基を有するサンプルへ標識することができます。SH基を有する場合、還元操作(操作3～6)を省略できます。
試料溶液中に標識対象以外の分子量10,000以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。あらかじめ試料溶液を精製し、ご使用ください。
Reducing Agentは、IgGへの標識用として最適化されています。IgG以外のS-S結合を有するサンプルをご使用になる場合は、S-S結合の切断によって標識対象分子の活性が失われる場合がありますので、検討が必要です。
試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、Filtration Tubeに水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブランの乾燥抑制剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。
本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれています。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので、開封前に振り落としてからご使用ください。

ヒンジ部以外のSS 結合が還元する場合があります。

	最大励起波長：564 nm 最大蛍光波長：575 nm
R-Phycoerythrin 標識タンパク質の励起・蛍光スペクトル

プロトコール

Immunoglobulin(IgG)への標識

操作1.
IgG50 ～ 200μg を含む試料溶液とWS Buffer 100 μl
をFiltration Tube に加える^a)。

操作2.
ピペッティングにより軽く混合した後、8,000 x g で10分間遠心する^b)。

操作3.
WS Buffer 150 μlをReducing Agentに加え、ピペッティングし溶解する。

操作4.
操作3の溶液100 μlをIgGが濃縮されているFiltrationTubeのメンブレン上に加える。

操作 5.
ピペッティングによりメンブレン上のIgGと混合した後、37℃で30分間反応する。

操作 6.
RA Solution 100 μl を加え、8,000 × g で10分間遠心する^b)。ろ液を捨てた後、RASolution 200 μl を加え、さらに遠心する^b)。

操作7.
Reaction Buffer 50 μl をSHReactive R-Phycoerythrin に加え、ピペッティングにより溶解する^c)。

操作8.
操作7 の溶液を還元IgGが濃縮されているFiltration Tubeのメンブレン上に加える。

操作 9.
ピペッティングによりメンブレン上の還元IgGと混合した後、37°Cで1 時間反応する。

操作10.
WS Buffer 150 μl を加え、10 回程度ピペッティングし、標識体を回収する^d)。
溶液をマイクロチューブに移し、0～5℃で保存する^e)。

a) 液量は100 μl 以下でご使用ください。IgG 濃度が0.5mg/ml 以下の場合には、操作1と2を繰り返してIgG 量が50～200μgとなるように濃縮してください。

b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに8,000 × gで5分間遠心してください。

c) SH-Reactive R-PhycoerythrinはReaction Buffer中で不安定になります。溶解後は直ちに操作8へ進んでください。

d) 1～2分子のフィコエリスリンが還元IgG 1分子に標識されます。また、回収した標識体には未反応のR-フィコエリスリンが残るので、イムノアッセイにおいてバックグラウンドへの影響が考えられます。
バックグラウンドを低減する必要がある場合は、ゲルろ過カラムやアフィニティーカラムなどにより精製を行ってください。

e) 標識体を回収する際は、WS Bufferのご使用を推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

Q&A

市販の抗体を用いて標識できますか？

標識できます。ただし、安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害される場合があります。このような抗体をご使用の場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどにより精製してご使用ください。精製法についてご不明な点がございましたらご相談ください。

使用できるタンパク質が少量しかないのですが･･･

本キットはタンパク質量50～200 μg でのご使用を推奨しておりますが、10 μg でも標識は可能です。ただし、10 μg のタンパク質を標識する場合は50 ～ 200 μg の場合と比較して、バックグラウンドの上昇などの問題が生じる可能性があります。

保存していた標識体が沈殿を生じましたが、使用できますか？

沈殿が生じた場合は、標識体を遠心分離(10,000 × g‚ 10 分間) し、上清をご使用ください。

蛍光標識したタンパク質を生細胞へ添加したいのですが、注意点はありますか？

細胞状態をより安定に保つため、生細胞懸濁液を調製する際は、2-10% FBS を含むPBS を用いることをお勧めします。

標識体を回収するWS Buffer は、生細胞へ影響しませんか？

WS Buffer 中には、細胞毒性を殆ど示さない量の安定化剤( 界面活性剤) を含んでいます。もし細胞への影響が気になる場合は、別途任意のバッファーを用いて標識体を回収してください。

R-Phycoerythrin Labeling Kit - SHLK26 取扱説明書