NADP/NADPH Assay Kit-WSTN510 取扱説明書

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)は主に、細胞内代謝経路の1つであるペントース・リン酸経路での反応に関与する補酵素です。NADPは細胞内において、酸化型のNADP⁺と還元型のNADPHとして存在しています。NADPHは、脂肪酸やコレステロールの生合成や、還元型グルタチオンの生成に関与しています。また、最近の研究で、糖質制限による寿命延長に、NADP⁺/NADPHが関連しているということが報告されています¹⁾。
NADP/NADPH Assay Kit-WSTは、細胞内の総NADP⁺/NADPH、NADPHおよびNADP⁺の定量、さらにNADP⁺とNADPHの比率を測定することができるキットです。本キットに含まれる抽出バッファーを用いて調製した細胞ライセートを加熱処理することにより、細胞内NADPHのみを定量することができ、別途測定した総NADP⁺/NADPH量からNADPH量を差し引くことで、細胞内NADP⁺量を求めることができます。

図1 NADP/NADPH Assay Kit-WSTによる測定原理

図2 NADP/NADPH Assay Kit-WSTを用いた総NADP⁺/NADPH量、NADPH量およびNADP⁺量の検出方法

0-5°Cで保存して下さい。

• プレートリーダー(450 nmの吸光フィルター)
• 96穴マイクロプレート
• インキュベーター(37 ℃、60 ℃)
• 20-200 μLのマルチチャンネルピペット
• 100-1000 μL、20-200 μL、2-20 μLマイクロピペット

• キットの中の試薬は、室温に戻してからご使用下さい。
• 輸送中の振動等により、内容物がアシストチューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合がありますので、開封前に振り落としてからご使用下さい。
• Enzymeは酵素懸濁液です。静置しておくと酵素が沈殿しますので、ピペッティングにより均一な懸濁液にしてご使用下さい。
• 正確な測定値を得るために、1つの測定試料につき複数(n=3以上)のウェルをご使用下さい。
• Working solutionをサンプルに加えると直ちに発色が始まります。各ウェル間のタイムラグによる測定誤差を少なくするためにマルチチャンネルピペットをご使用ください。
• 測定試料は、検量線範囲内に入るように希釈したものを数種類調製し、測定に用いて下さい。

Dye Mixture stock solutionの調製

Dye Mixtureに超純水550 μLを加え、転倒混和により溶解する。

• 内容物がチューブ底面から外れ、チューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合があります。開封前に内容物を底面に落としてからご使用下さい。
• Dye Mixture stock solutionは、遮光下、-20 ℃以下で保存して下さい(2ヶ月間安定)。

Standard stock solution (10 mmol/L)の調製

Standardに超純水 20 μLを加え、ピペッティングにより溶解する。

• 内容物がチューブ底面から外れ、チューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合があります。開封前に内容物を底面に落としてからご使用下さい。
• Standard stock solutionは氷浴上で使用し、溶解後は-20℃以下で保存して下さい(2ヶ月間安定)。

Working solutionの調製

1. コニカルチューブにDye Mixture stock solutionを加え、Assay Bufferで希釈する。
2. 操作1.で調製した溶液にEnzymeを加える。

• Working solution調製における各溶液使用量は、表1を参照して下さい。
• Working solutionは光に不安定であるため、使用直前に調製し、調製後はアルミホイルで覆うなどして遮光して下さい。また、調製後のWorking solutionは保存できません。その日のうちにお使い下さい。

	48ウェル分	96ウェル分
Dye Mixture stock solution	270 µL	540 µL
Assay Buffer	2.43 mL	4.86 mL
Enzyme	54 µL	108 µL

表1 Working solution調製例

1. 測定用サンプルの調製 

1. 細胞(5-40×10⁵ cells)を1.5 mLマイクロチューブに準備する。
2. 300×gで5分間遠心し、上清を除去する。
3. PBS 500 μLを加え、ピペッティングにより懸濁後、300×gで5分間遠心し、上清を除去する。
4. NADP/NADPH Extraction Buffer 300 μLを加え、ピペッティングにより細胞を溶解した後、12,000×gで5分間遠心する。
   • ピペッティング後、溶液の粘性が高いと遠心後の分離が困難になる場合があります。その際は、シリンジに25G程度の細い針を付け、サンプル溶液をシリンジでスムーズに出し入れができるまで(20-30回)混合してお使い下さい。
5. 上清250 μLをMWCO 10Kフィルトレーションチューブに移し、12,000×gで10分間遠心する。
   • 測定用サンプルは、総NADP⁺/NADPH量およびNADPH量の両方を測定する場合、合計200 μL以上は必要です。
   • 遠心後の濾液が200 μL以上ない場合は、遠心時間を延長して下さい。
6. 得られた濾液を、1.5 mLマイクロチューブ2本に100 μLずつ移し、総NADP⁺/NADPH量およびNADPH量測定試料とする(図3参照)。
7. NADPH量測定試料を60 ℃で60分間インキュベートする。
   • 本操作により、NADPH量測定試料中に含まれるNADP⁺を分解します。
   • 総NADP⁺/NADPH量測定試料は測定までの間、氷浴中で保存して下さい。
8. インキュベート後、測定試料を室温まで冷却する。
9. 操作6.および操作8.で調製した、総NADP⁺/NADPH量およびNADPH量測定試料が入ったチューブそれぞれに、NADP/NADPH Control Buffer 100 μLを加えたものを測定に用いる(Sample)。
   • 測定試料は1ウェルあたり50 μL必要です。
   • 測定試料は、検量線範囲内に入るようにNADP/NADPH Control Bufferで希釈したものを数種類調製してから測定して下さい。

図3 測定サンプルの調製方法

2. Standard solutionの調製

1. 10 mmol/L Standard stock solution 2 μLを超純水198 μLで希釈し、100 μmol/L Standard solutionを調製する。
2. 操作1.で調製した100 μmol/L Standard solution 5 μLをさらにStandard Buffer 495 μLで希釈し、1 μmol/L Standard solutionを調製する。さらに順次2倍希釈していき、標準液(1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0313, 0.0157, 0 μmol/L)とする(図4参照)。

図4 Standard solutionの調製方法

3. 測定

1. Standard solutionおよびSampleを50 μLずつ、各ウェルに入れる(図5参照)。
   • 正確な測定値を得るために、1つの測定試料につき複数(n=3以上)のウェルをご使用下さい。
2. Working solution 50 μLを各ウェルに入れる。
   • Working solutionを加えると直ちに発色が始まります。各ウェル間のタイムラグを少なくするためにマルチチャンネルピペットをご使用下さい。
3. 37 ℃で60分間インキュベートする。
   • インキュベートする際は、溶液の揮発を防ぐため、マイクロプレート用シール等をご使用下さい。
4. プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定する。
5. 測定試料(Sample)中の総NADP⁺/NADPH量およびNADPH量を検量線より求める。
   これにより求められた値は、調製した測定試料溶液中の濃度です。希釈前の試料中に含まれる濃度は、得られた測定値と試料の希釈倍率より算出して下さい。
   • これにより求められた値は、調製した測定試料溶液中の濃度です。希釈前の試料中に含まれる濃度は、得られた測定値と試料の希釈倍率より算出して下さい。
   • NADP⁺量は以下の計算式より算出します。
     NADP⁺量＝総NADP⁺/NADPH量－NADPH量

Jurkat細胞中総NADP⁺/NADPH量、NADP⁺量、NADPH量、NADP⁺/NADPH比の解析

1. Jurkat細胞(1.0および2.0×10⁶ cells/tube)をそれぞれ1.5 mLマイクロチューブに回収した。
2. 300×gで5分間遠心し、上清を除去した。
3. PBS 500 μLを加え、ピペッティングにより懸濁後、300×gで5分間遠心し、上清を除去した。
4. NADP/NADPH Extraction Buffer 300 μLを加え、ピペッティングにより細胞を溶解した後、12,000×gで5分間遠心した。
5. 上清250 μLをMWCO 10Kフィルトレーションチューブに移し、12,000×gで10分間遠心した。
6. 得られた濾液をそれぞれ1.5 mLマイクロチューブ2本に100 μLずつ移し、総NADP⁺/NADPH量およびNADPH量測定試料とした。総NADP⁺/NADPH量測定試料は測定まで氷浴中にて保存した。
7. NADPH量測定試料を60 ℃で60分間インキュベートし、室温まで冷却した。
8. 総NADP⁺/NADPH量およびNADPH量測定試料が入ったチューブに、NADP/NADPH Control Buffer 100 μLをそれぞれ加え、測定試料とした。
9. Standard solutionを調製し、標準液を調製した(Standard solutionの調製参照)。
10. 調製した測定試料およびStandard solutionを50 μLずつ、96穴プレートに入れた。
11. 調製したWorking solution 50 μLを各ウェルに加えた。
12. 37 ℃で60分間インキュベートした。
13. プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定し、測定試料中総NADP⁺/NADPH量およびNADPH量を検量線より求めた。NADP⁺量は、求めた総NADP⁺/NADPH量からNADPH量を引くことにより算出した。

図7 Jurkat細胞中総NADP⁺/NADPH量、NADP⁺量、NADPH量およびNADP⁺/NADPH比

1. Richard L. Veech, et al., IUBMB Life., 2017, 69, 305.