-SulfoBiotics- Biotin-HPDP(WS) solutionSB17 取扱説明書

　Biotin-HPDP(WS)は、Biotin-HPDP（製品コード B573） を改良した新しい水溶性ビオチンラベル化剤です。
　Biotin-HPDPは、タンパク質のスルフヒドリル(SH) 基に可逆的なジスルフィド結合を介してビオチンを導入することができる試薬です。このジスルフィド結合は、還元剤によって容易に切断できるため、アビジン固定化樹脂などを用いたビオチンラベル化タンパク質の精製に有用です(Fig.1)。また、このような特性から、ニトロシル化、スルフヒドリル化、パルミトイル化などのタンパク質のチオール修飾解析（Biotin Switch Assay) に汎用されています。
　しかしながら、Biotin-HPDPはDMSO、DMF、水などの溶媒に対する溶解性が低いため、溶液調製が困難という問題を抱えておりました。
　- SulfoBiotics-​ Biotin-HPDP(WS) solution は、Biotin-HPDPの溶解性の問題を克服し、使用しやすい20 mmoll の水溶液タイプとした製品です。

図 1 Biotin-HPDP(WS) によるチオール修飾およびタンパク質回収

20 mmol/l Biotin-HPDP(WS) solution

500 μl x 1

冷蔵（0-5°C）にて保存してください。

輸送中の振動により、内容物がチューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合がありますので、遠心してからご使用ください。

実験系に応じて適当なバッファーや水に希釈し、ご使用ください。

• ジチオスレイトール(DTT)やメルカプトエタノールなどの選元剤はラベル化反応に影響を及ぼすため、使用しないで下さい。

GAPDH のビオチンラベル化及びアビジン樹脂を用いた回収

＜必要なもの＞

• インキュベーター（37℃）
• マイクロピペット（20 μl, 200 μl,1 ml)
• 遠心機
• マルチイメージャー
• 1.5ml マイクロチューブ
• 10 K Filtration tube
• Lysis buffer : 6 mol/l Urea, 2% SDS, 150 mmol/ Tris-HCl (pH7.4) の水溶液
• RIPA buffer : 50 mmol/ Tris-HCl (pH8.0), 150 mmol/ NaCl, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1% NP-40
• Neutravidin™ Agarose (Thermo Fisher Scientific)
• Neutralization buffer : 20 mmol/l HEPES (pH7.7), 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, 0.5% TritonX-100
• Neutralization buffer (+600 mmol NaCl) : Neutalization buffer, 600 mmol NaCl
• Elution buffer : 20 mmol/l HEPES (pH 7.7). 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, 100 mmol/l 2-Mercaptoethanol
• Loading Buffer :10% SDS, 50% Glycerol, 0.2 mol/l Tris-HCl (pH 6.8), 0.05% Bromophenol blue

 

＜操作＞

1. 1 mg/ml に調整した GAPDH (36 kDa) の PBS 溶液 10 μl をマイクロチューブに入れ、Lysis buffer 35 μl、100 mmol/l DTT (Lysis buffer) 溶液5 μlを加え、よく混合した。
2. マイクロチューブを37℃で30分間インキュベートした後、溶液全量を 10K Filtration tube に移し、12,000 rpm で10分間遠心した。
3. PBS 50 μlを操作2のチューブに加え、12,000 rpmで10分間遠心した。
4. 操作3をもう一度行った。
5. RIPA buffer 126 μl、4 mmol/l Biotin-HPDP(WS) 水溶液 14 μlを加え、よく混合した（終濃度400 μM）。
6. 37℃で1時間インキュベートした後、12,000 rpm で10分間遠心した。
7. PBS 50 μl を操作7のチューブのメンブレン上に加え 12,000 rpmで10分間遠心した。
8. 操作7をもう一度行った。
9. Neutralization buffer 400 μlを加えてピペッティングでメンブレン上のタンパク質を溶解し、マイクロチューブに全量移した。
10. 操作9のマイクロチューブから50 μlの溶液をとり、あらかじめ Neutralization buffer で洗浄しておいたNeutravidin^TM Agarose に加えよく混合した。
11. 4℃で1時間静置した。
12. 2,500 rpm で1分間遠心し、ピペットマンで上澄みを除去した。
13. Neutralization buffer(+600 mmol/l NaCl) 1 ml を加え、2,500 rpm で1分間遠心し、上澄みを除去した。
14. 操作 13を2回行った。
15. Neutralization buffer 1 ml を加え、2,500 rpmで1分間遠心し、上澄みを除去した。
16. 操作 15をもう一度行った。
17. Elution buffer 50 μl を加え、ボルテックスで良く混合した後、4℃で1時間静置した。
18. 2,500 rpm で1分間遠心した後、上清（回収したタンパク質溶液）を1.5ml マイクロチューブに移した。
19. 上清 10 μlに Loading Buffer 2 μl を加えよく混合し、SDS-PAGE（CBB 染色）およびウエスタンブロットにより解析した。

 

1. S. R. Jaffrey and Solomon H. Snyder, "The Biotin Switch Method for the Detection of S-Nitrosylated Proteins", Sci. STKE, 2001, 86, pl1.
2. X. Wang. N. Kettenhofen, S. Shiva, N. Hogg, and M. Gladwin, "Copper dependence of the biotin switch assay : modified assay for measuring cellular and blood nitrosated proteins", Free Radic. Biol. Med., 2008, 44, 1362.
3. M. T. Forrester, M. W. Foster, M. Benhar, and J. S. Stamler, "Detection of Protein S-Nitrosylation with the Biotin Switch Technique", Free Radic. Biol. Med., 2009, 46(2), 119.
4. M. D. Kornberg, N. Sen, M. R. Hara, K. R. Juluri, J. V. K. Nguyen, A. M. Snowman, L. Law, L. D. Hester, and S. H. Snyder, "GAPDH Mediates Nitrosylation of Nuclear Proteins". Nat. Cell Biol., 2010, 12(11), 1094.
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6. A. K. Mustafa, M. M. Gadalla, N. Sen, S. Kim, W. Mu, S. K. Gazi, R. K. Barrow, G. Yang, R. Wang, and S. H.
   Snyder, "H2S Signals Through Protein S-Sulfhydration", Sci. Signal., 2009, 2(96), га72.