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硫化水素研究用試薬およびキット

　近年、毒ガスとして知られている硫化水素（H₂S）が、血管拡張や細胞保護、インスリン分泌や神経伝達調節など様々な生理活性を示すことが明らかにされ（Fig. 1）、一酸化窒素（NO）や一酸化炭素（CO）に続く第 3 のガス状シグナル分子として注目されています。

　生体内に存在する硫化水素は、主に L- システインを基質としてシスタチオニンβ- シンターゼ（CBS）やシスタチオニンγ- リアーゼ（CSE）、3- メルカプトピルビン酸サルファトランスフェラーゼ（3-MST）と呼ばれる酵素類によって産生され、生理活性を示すと共に、システイン側鎖の SH 基に付加した結合型硫黄として生体内に貯蔵されると考えられています。硫化水素は、NO や CO と同様にガス状分子として認知されていますが、その pK_a は約 7 であり、生理的 pH では約 80 ％が硫化水素イオン（HS^－）の状態で存在します（Fig. 2）。また、硫化水素イオンは生体内で様々な結合形態や構造をとるため、その作用機序の詳細は未だ不明であり、硫化水素を中心とした硫黄の生体内機能の解明が待ち望まれています（概要はドージンニュース 146 号「生理活性物質としての硫化水素」および 148 号「硫化水素による膵 B 細胞保護」をご参照ください）。

　小社では現在、このような研究背景の中、硫化水素研究に有用な試薬およびキットの開発を行っております。ご興味、ご要望などありましたら、お気軽に小社までお問合せください。

硫化水素ドナー Na₂S

＜特長＞
　・硫化水素研究用として規格化
　・秤量しやすい粉末タイプ

　硫化ナトリウム（Na₂S）は、硫化水素研究には欠かせない硫化水素ドナーであり、硫化水素ナトリウム（NaHS）と共に汎用されています。しかしながら、現在用いられている硫化ナトリウムは、有機合成用のため数十～数百 g という大きな容量で、一つのボトルにペレットの状態で販売されています。硫化水素研究において必要となるのは mg オーダーであるため、購入した硫化ナトリウムの多くは無駄となる他、長期保存による劣化の問題が生じます。また、メーカーあるいは製造ロットによって純度や組成が異なるため、実験の再現性に影響を及ぼすことが懸念されます ^1）。そこで小社では、硫化水素研究用の硫化ナトリウムを開発しております。本試薬は秤量しやすい粉末タイプです。またメチレンブルー法による分析によって規格化し、品質を管理しておりますので、硫化水素研究用として安心してご使用頂けます。

加水分解性徐放型　硫化水素ドナー

　硫化ナトリウム（Na₂S）や硫化水素ナトリウム（NaHS）は、最も一般的な硫化水素ドナーとして硫化水素研究に用いられています。しかしながら、水に溶解するとすべて硫化水素（イオン）に変換されるため、一過性の硫化水素刺激しか与えることができません。そのため、近年数多くの徐放型の硫化水素ドナーが開発されてきております。 GYY4137 は、P. K. Moore らによって開発された徐放型の硫化水素ドナーであり、加水分解によって持続的に硫化水素を放出する試薬です（Fig. 4） ^2）。そのため、硫化ナトリウムや硫化水素ナトリウム添加のような一過性の刺激では観察されない細胞応答を引き起こすことが確認されています ^{2, 3）}。このような硫化水素ドナーを用いることでより詳細な硫化水素の生体内機能解析や新規の薬剤開発につながることが期待されます。

還元物質応答性　硫化水素ドナー

　硫化水素研究において、硫化水素の量や発生速度はその生理活性を決める重要な因子となります。しかし現在、一般的に硫化水素ドナーとして使用されている硫化ナトリウム（Na₂S）や硫化水素ナトリウム（NaHS）は、水溶液中に添加するだけで硫化水素を生成するため、硫化水素の発生量や発生時間を制御することは困難です。

　 M. Xian らが開発した硫化水素ドナーは、生体内に存在する還元物質（グルタチオンやシステインなど）に応答して硫化水素を発生する新規の硫化水素ドナーで、その構造の違いによって硫化水素の発生時間と発生量が異なります（Fig. 5） ^{4, 5）}。これらドナーの硫化水素発生機構は、生体内の硫化水素産生メカニズムに基づいており、パーサルファイドを経由して硫化水素を発生します。そのため、硫化水素研究を行う上で大変興味深い化合物だと考えられます。

硫化水素イオン比色定量用キット（メチレンブルー法）

＜特長＞
　・比色法により硫化水素を定量することができる
　・マイクロプレートを用いた多検体測定が可能
　・酸に不安定な結合型硫黄の影響を受けない

　メチレンブルー法は、最も一般的な硫化水素イオン定量法の一つです。本手法は、酸性条件、塩化鉄（III）存在下で N,N-Dimethyl-p-phenylenediammonium（DPDA）と硫化水素が反応してメチレンブルーを生成する機構に基づいており、生成したメチレンブルー由来の 650 nm 付近の吸光度から硫化水素を定量することができます ^6）。ただし、本手法は酸性条件下で反応を行うため、生体試料中に含まれる酸に不安定な結合型硫黄由来の硫化水素の反応への関与が示唆されており、実際の生体内硫化水素の絶対定量には適していないと考えられています ^7-10）。そこで小社では、このような結合型硫黄の影響を受けず、遊離の硫化水素イオンを特異的に検出できるキットの開発を行っております。

＜キット内容＞
･Na₂S Standard ･1％ Zinc Acetate ･DPDA ･FeCl₃ solution	×1 ×1 ×2 ×1

硫化水素 HPLC 検出用キット（Monobromobimane 法）

＜特長＞
　・Monobromobimane を用いた高感度 HPLC 検出が可能
　・標準物質である Sulfide-dibimane を付属

　Monobromobimane を用いた HPLC 分析法は、最も高感度で汎用性の高い硫化水素検出法として利用されています。 Monobromobimane は、チオール特異的蛍光ラベル化剤であり、硫化水素 1 分子に対し、Bimane 2 分子が標識された特異的な化合物（Sulfide-dibimane）を生成します。そのため、グルタチオンやシステインなどの他のチオール基を有する物質との分離が可能であり、また生成した化合物が蛍光を有するため、蛍光検出による高感度分析ができます ^11-13）。また、最近では質量分析装置と併用することでさらに高感度化と高選択性を達成した方法が報告され、硫化水素だけではなく、SH 基を有する種々の生体物質の詳細な解析法として確立されつつあります ^{14, 15）}。
　本キットには、反応に必要な試薬類および標準物質である Sulfide-dibimane が含まれています。

＜キット内容＞
･Monobromobimane ･Reaction buffer ･Sulfide-dibimane	×3 ×1 ×1

硫化水素研究用　サルフェン硫黄ドナー類

　硫化水素の細胞内機能を議論する上で、硫黄原子が連結したパーサルファイドやポリサルファイドのようなサルフェン硫黄は欠かせない存在となってきております。このようなサルフェン硫黄は、硫化水素の産生や貯蔵、放出だけでなく、スルフヒドリル化などのタンパク質内チオールをターゲットとしたシグナル伝達にも関与していることが示唆されており ^16）、硫化水素に関連する研究分野は大きな広がりを見せつつあります。木村らは、実際に脳内で硫化水素からポリサルファイドが生成することを発見し、このポリサルファイドが脳内の神経伝達を増強していることを明らかにしています^17）。また石井らは、ポリサルファイドである四硫化ナトリウムが Keap1/Nrf2 のスルフヒドリル化を介して酸化ストレスに対する高い細胞保護機能を発揮することを示しています ^18）。
　現在、小社ではこのような幅広い硫化水素関連の研究に対応するため、硫化水素研究用のポリサルファイドを開発しております（Fig. 12）。有機合成用として三硫化ナトリウムや四硫化ナトリウムは市販されていますが、メーカーやロットによって品質が異なります（Fig. 13）。そこで小社では、硫化水素研究用として高品質のポリサルファイドを開発しております。 Fig. 14 にはそれぞれの水溶液の吸収スペクトルを示しておりますが、硫黄数に比例した 370 nm 吸光度の増加が観察されております。

サルフェン硫黄検出用蛍光プローブ

　硫黄原子が連なって結合したサルフェン硫黄は、硫化水素の生体内プールとして存在するだけではなく、タンパク質の S-スルフヒドリル化を介したシグナル伝達に寄与していることが明らかとなり、近年非常に注目されてきております。 M. Xian らが開発した蛍光プローブ SSP2 は、サルフェン硫黄と特異的に反応して強い蛍光を発する試薬であり、サルフェン硫黄の蛍光検出や細胞内動態の解析に有用です（Fig. 15，16） ^19）。現在、小社では SSP2 よりも高感度な蛍光プローブ SSP4 の製品化を検討しております。 SSP4 は SSP2 の約 300 倍感度が高く、細胞内イメージングへの適用も可能です（Fig. 17）。