IntactMito Fractionation Kit for Tissue
組織用ミトコンドリア分画キット
- 摘出した臓器から約2時間でミトコンドリアを分画できる
- 活性の高いミトコンドリアを分画できる（OCR：Oxygen Consumption Rate 測定可能）
- 専用Buffer３種と遠心用チューブを同梱
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製品コードMT17 IntactMito Fractionation Kit for Tissue
| 容 量 | メーカー希望 小売価格 |
富士フイルム 和光純薬 |
|---|---|---|
| 10 tests | ￥55,000 | 348-10341 |
【ご注意】
ミトコンドリア活性の評価には、別途コハク酸等を添加する必要があります。詳細は本ページの技術情報もしくは、よくある質問の"分画したミトコンドリアを評価する際に注意することはありますか？"をご覧ください。
| 10 tests | ・Homogenization Buffer ・Resuspension Buffer ・Stabilization Buffer ・Reagent A ・Reagent B ・Centrifuge Tube |
50 ml ×1 15 ml ×1 15 ml ×1 150 g ×2 5 g ×1 30 tubes |
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組織由来のインタクトなミトコンドリアを用いた活性評価
病態をより深く理解するためには、細胞単位での評価に加えて組織のミトコンドリア活性を捉えることが重要です。
本キットは、ミトコンドリアが活性を保持している状態（＝インタクトな状態）で組織から分画することが可能です。分画したミトコンドリアを解析することで、老化や病態、さらには薬剤による個体状況の変化を反映したミトコンドリア活性を直接評価できます。
ミトコンドリア活性評価関連製品
| 製品名 | 測定対象 | 装置 / 検出波長 |
|---|---|---|
| Extracellular OCR Plate Assay Kit | 細胞外酸素濃度 | プレートリーダー 蛍光 Ex: 500 nm / Em: 650 nm |
| JC-1 MitoMP Detection Kit | ミトコンドリア膜電位 | 蛍光顕微鏡, FCM, プレートリーダー 蛍光 緑：Ex 488 nm / Em 500-550 nm 赤 ：Ex 561 nm / Em 560-610 nm |
| ATP Assay Kit-Luminescence | ATP | プレートリーダー 発光 |
| MitoComplex-I Activity Assay Kit | Complex I活性 | プレートリーダー 比色 λ= 340 nm |
技術情報
ミトコンドリア分画操作
本キットには専用のBuffer3種と遠心用チューブが含まれており、摘出した臓器から約2時間でインタクトなミトコンドリアを分画できます。
※ホモジナイザーは別途ご準備いただく必要がございます。
本製品は、東京科学大学所属 清水重臣先生、鳥居暁先生のご指導の下、製品化しました。
インタクトなミトコンドリアの分画
本キットを用いて、マウス脳組織から分画したミトコンドリアにコハク酸(Succinate)を添加し、OCR測定を行いました。
結果、本キットでは酸素消費能を維持したインタクトなミトコンドリアを分画できていることが分かりました。
マウス脳組織から分画したミトコンドリアのOCR測定
＜実験条件＞
ミトコンドリア量: 50 μg/well (タンパク質量として)
Succinate: 10 mmol/l
使用製品: Extracellular OCR Plate Assay Kit（製品コード：E297）
実験例：マウス脳組織から分画したミトコンドリアの活性評価
マウスの脳組織から本キットを用いてミトコンドリアを分画し、酸素消費速度（OCR)、ミトコンドリア膜電位（MMP）およびComplex I 活性を測定しました。
この結果、電子伝達系のCoｍplex IIを活性化する基質であるコハク酸(succinate)を添加するとOCRおよびMMPが増加し、FCCP処理後のMMPが減少したことから、インタクトなミトコンドリアが分画できていることを確認しました。 さらにComplex I活性測定では、Complex I阻害剤であるRotenone処理による活性の低下を確認しました。
＜実験条件＞
OCR測定
ミトコンドリア量: 50 μg/well (タンパク質量として)
Succinate: 10 mmol/l
MMP検出
ミトコンドリア量: 50 μg/well (タンパク質量として)
Succinate: 10 mmol/l, FCCP: 4 μmol/l
Complex I 活性測定
ミトコンドリア量：20 μg/well (タンパク質量として)
Rotenone: 10 μmol/l
＜使用製品＞
ミトコンドリアの分画：IntactMito Fractionation Kit for Tissue (製品コード:MT17)
OCR測定: Extracellular OCR Plate Assay Kit (製品コード:E297)
MMP検出: JC-1 MitoMP Detection Kit (製品コード:MT09)
Complex I活性測定: MitoComplex- I Activity Assay Kit (製品コード:MT18)
よくある質問
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Q
細胞からミトコンドリアの分画はできますか。
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A
キットのプロトコルと遠心用チューブは細胞サンプルには対応していないため、細胞からミトコンドリアの分画は出来ません。
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Q
使用実績のある臓器を教えてください。
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A
脳、肝臓、心臓を使用した実績があります。
脳および肝臓からの分画操作は取り扱い説明書をご参照ください。
心臓からの分画は別途前処理が必要です。ご要望のお客様は、弊社カスタマーサポートまでお問い合わせください。
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Q
分画できるミトコンドリア量と、必要な組織量を教えてください。
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A
マウスの脳、肝臓を用いてミトコンドリア分画した際の実績は以下の通りです。
・脳：臓器0.4 g程度(1匹分)から、最終沈殿物のミトコンドリア量：5 mg前後（タンパク質量として）
・肝臓：臓器0.8 g程度(1匹分)から、最終沈殿物のミトコンドリア量：7 mg前後（タンパク質量として）なお、脳：臓器1.2 g程度(3匹分)を用いた際には最終沈殿物のミトコンドリア量：10 mg前後(タンパク質量として)分画した実績があります。
臓器量を倍に増やした場合でも、回収量は必ずしも比例して増加しない点にはご留意ください。
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Q
臓器間で分画したミトコンドリアに違いはありますか？
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A
はい。本キットで分画したミトコンドリアは臓器ごとで異なる場合があります。
脳と肝臓を用いて、分画ステップの以下4点にて核、細胞質、ミトコンドリアのマーカー発現量をウエスタンブロットで確認しました。
＜タンパク質量＞
10 µg/lane＜各マーカー＞
核：Lamin A/C (60-80 kDa)
ミトコンドリア：COX IV (10-20 kDa)
細胞質➀：β-Actin (40-50 kDa)
細胞質➁：GAPDH (30-40 kDa)最終分画物➂では、脳、肝臓ともにミトコンドリアマーカーが検出され、ミトコンドリアが分画できていることを確認しました。
一方、脳サンプルでは最終分画物➂においては細胞質画分の共存を確認しました。
臓器間の活性を比較する際には、最終分画物の精製度を予め確認することを推奨いたします。
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Q
分画したミトコンドリアを評価する際に注意することはありますか？
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A
ミトコンドリアの構造的評価（複合体の酵素活性、タンパク量など）の場合には分画したサンプルをそのまま使用できます。一方で、機能的評価（例：酸素消費量、膜電位など）を行う場合には、基質の添加が必要です。
酸素消費量およびミトコンドリア膜電位評価にはコハク酸（Succinate）を添加し測定した実績がございます。
コハク酸溶液の調製実績
コハク酸ストック溶液(0.25 mol/l コハク酸水溶液を5 mol/l KOHにてpH中性に調製）を、Stabilization Buffer solutionで既定の濃度になるよう希釈した。
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Q
分画したミトコンドリアの定量方法を教えてください。
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A
小社では、BCA法を用いたタンパク質濃度の定量を行った実績があります。
分画に用いるBuffer中にはミトコンドリアを安定化するため、全てに等量のタンパク質が含まれます。そのため、タンパク質濃度定量の際にはStabilization Buffer solution単独でのブランクを測定し、サンプルから差し引いてタンパク質濃度を算出してください。
取扱条件
| 保存条件: 冷蔵, 湿気厳禁 |
