他社製品との比較

共染色でエンドソームとの観察が可能に

ラベル化 IgG の細胞内取り込みの経時観察 

本キットを用いて染色した AcidSensor 標識マウス IgG と小社エンドサイトーシス検出色素（製品コード : E296, ECGreen -Endocytosis Detection）を HeLa 細胞に添加し、10 分、20 分、180 分後の AcidSensor 標識体（紫）とエンドソーム膜を同時に観察しました。 その結果、AcidSensor 標識マウス IgG が経時的に細胞内に取り込まれ、その蛍光輝点がエンドソームと共局在していることから、IgG がエンド サイトーシス経路で細胞内に取り込まれたことが確認されました。

＜検出条件＞
緑：ECGreen (Ex = 405 nm, Em = 500-550 nm)
紫：AcidSensor (Ex = 633 nm, Em = 650-700 nm)

実験例：AcidSensor 標識 BSA、Mouse IgGの HeLa への取り込み実験

本キットを用いて標識したBSAまたはMouse IgGをHeLa細胞に添加し、2時間後のHeLa細胞の取り込みを観察しました。その結果、HeLa細胞内にAcidSensorの蛍光輝点が検出され、標識した対象物がそれぞれエンドサイトーシス経路にて取り込まれていることが確認できました。

＜検出条件＞
検出装置：共焦点レーザー顕微鏡
Ex = 633 nm, Em = 650-700 nm

応用例: AcidSensor 標識アポトーシス細胞を用いたファゴサイトーシス活性評価

AcidSensor 標識体がマクロファージ等の細胞に取り込まれ、酸性環境下に到達することで Deep Red 蛍光が増大します。AcidSensor で Jurkat 細胞を標識後にアポトーシスを誘導し、さらに Calcein-AM で染色した THP-1 細胞由来マクロファージと共培養することで、アポトーシス細胞に対するファゴサイトーシスを評価しました。
その結果、フローサイトメトリーにて Calcein (Green) と AcidSensor (Deep Red) のダブルポジティブ細胞が観察されました(図1a) 。さらに、Cytochalasin D を用いて THP-1 細胞由来マクロファージのファゴサイトーシス機能を阻害したところ、ダブルポジティブ細胞の割合が減少したことから (図1b、1c) 、アッセイ系が正確にファゴサイトーシスを評価できていることが確認できました。

図１

近年の研究では、貪食細胞のミトコンドリア機能が阻害されることで細胞のエネルギー代謝が解糖系へシフトし、さらに貪食機能が低下することがわかっています*。実際に FCCP 存在下でファゴサイトーシスを評価したところ、 THP-1 細胞由来マクロファージのミトコンドリア膜電位 (MT-1, Red) 低下と (図2) 貪食作用の低下 (図3) が同時に観察されました。
*LH. Fairley, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2023, 120(8):e2209177120.

図２

図３

[実験手順]
＜AcidSensor 標識アポトーシス誘導細胞の準備 (Assay 前日)＞

1. NH₂-Reactive AcidSensor に DMSO 10 μl を加え溶解させた。
2. 5 μl NH₂-Reactive AcidSensor 溶液 を 5 ml HBSS (+) に加え Working solution を作製した (1000 倍希釈)。
3. Jurkat 細胞を HBSS (+) で 2回洗浄した。
4. 5×10⁷ cells のJurkat 細胞をチューブに取り、遠心後に上清のみを取り除いた。
5. Jurkat 細胞を 5 ml Working solution で懸濁した (1×10⁷ cells/ml)。
6. 37℃ で 30 分間インキュベートし、AcidSensor 標識した。
7. 標識後、HBSS (+) で 2回洗浄した。
8. AcidSensor 標識 Jurkat 細胞を、0.5 μM スタウロスポリンを加えた培養培地 (10% FBS 入りRPMI 培地) に懸濁した。
9. インキュベータ内 (37℃、5% CO₂存在下) で o/n 培養 (18時間) を行い、アポトーシスを誘導した。
10. アポトーシス誘導後、培養培地で洗浄しファゴサイトーシスアッセイに用いた。

＜THP-1 細胞由来マクロファージを用いたファゴサイトーシスアッセイ＞

1. マクロファージへ分化させるため、THP-1 細胞を 1x10⁶ cells/ well となるように 6 well プレートに播き、100 nM PMA を加えインキュベータ内で 3日間培養した。
2. THP-1由来マクロファージを HBSS (+) で 2回洗浄後、 0.5 μg/ml Calcein-AM と MT-1 dye (Code: MT13、1000倍希釈) を含む HBSS (+) 溶液を加え、インキュベータ内で 30 分間インキュベートした。
3. 培養培地で2回洗浄した。
4. 10 μM Cytochalasin D で 1 時間、または 5 μM FCCP で 30 分間、薬剤を加えてインキュベータ内でインキュベートした。
5. 培養培地で2回洗浄後、上清を取り除いた。10 μM Cytochalasin D または 5 μM FCCPを含む培養培地で AcidSensor 標識アポトーシス誘導 Jurkat 細胞を懸濁し、3x10⁶ cells/ well となるように加えた後、インキュベータ内 で 4時間インキュベートした。
6. HBSS で2回洗浄した。
7. Imaging Buffer solution (Code: MT13) 500μ を加え、セルスクレーパーを用いてTHP-1由来マクロファージを剥がした。
8. 細胞懸濁液を回収し、フローサイトメトリーにて解析した。