これから始める細胞死研究

細胞死は、組織の恒常性を維持し、細胞ストレスに対応するために不可欠な生物学的プロセスです。従来、プログラム細胞死につながる細胞シグナルによって引き起こされるアポトーシスと、外傷や感染症によって引き起こされるネクローシスが主な種類と考えられてきました。最近の研究では、鉄依存性脂質過酸化によるフェロトーシスや、細胞成分の過剰な自己消化によるオートファジー依存性細胞死など、いくつかの他のメカニズムが特定されており、より詳細な経路別の解析が求められています。

同一サンプルを複数指標で評価できる
細胞サンプルを細胞と上清に分け、それぞれを異なる指標（試薬の併用）で測定することで、細胞死のより詳細な解析が実現します。

アポトーシス誘導剤であるStaurosporinまたはフェロトーシス誘導剤であるErastin、RSL3で処理したHepG2細胞の細胞外LDH、ホスファチジルセリン、細胞生存率、細胞内Fe^2＋、脂質過酸化の変化を解析しました。
その結果、Staurosporinで処理したアポトーシス誘導細胞ではホスファチジルセリンの増加、細胞生存率の低下並びに細胞外LDHが増加し細胞死が起きていることが確認できました。一方でフェロトーシス指標である細胞内Fe^2＋は変化がありませんでした。フェロトーシス誘導剤であるErastinで処理した細胞では細胞内Fe^2＋の増加と細胞生存率の低下が確認されましたが、細胞外LDHと脂質過酸化（脂質過酸化：赤色蛍光の減少と緑色蛍光の増加）は増加しませんでした。Erastinに加えてRSL3を同時に処理し、より強力にフェロトーシスを誘導した細胞では、フェロトーシスの指標である細胞内Fe^2＋と脂質過酸化の増加並びに細胞生存率の低下が確認され、死細胞が増加しました。一方で、ホスファチジルセリンはアポトーシス誘導細胞と比較し、フェロトーシス誘導時には増加率が低い結果となりました。これらの結果から、細胞死の指標を組み合わせて評価することで細胞死を見分けられることがわかりました。

＜使用製品＞
細胞外LDH　　　　　：Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（製品コード：CK12）
ホスファチジルセリン：Annexin V Apoptosis Plate Assay Kit（製品コード：AD12）
細胞生存率　　　　　：Cell Counting Kit-8（製品コード：CK04）
細胞内Fe²⁺　　　　　：FerroOrange（製品コード：F374） *Hoechst 33342の蛍光強度で補正
脂質過酸化　　　　　：Lipid Peroxidation Probe -BDP 581/591 C11-（製品コード：L267）

＜実験条件＞
細胞：HepG2細胞(2×10⁴ cells/well)
薬剤：Staurosporin(5 μmol/l), Erastin(25 µmol/l), Erastin+RSL3(どちらも25 µmol/l)
　　　*無血清培地に希釈して添加

アポトーシス阻害剤 Z-VAD で前処理した Jurkat 細胞と、Z-VAD で前処理をしていない Jurkat 細胞を Staurosporineで処理した場合の細胞外 ATP 放出(Extracellular ATP Assay Kit-Luminescence)、細胞増殖(CK04：Cell Counting Kit-8)、細胞外 LDH(CK12：Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST)の時間変化を評価しました。その結果、Z-VAD によって細胞死は阻害されましたが、アポトーシスの初期段階で放出される細胞外 ATP は時間経過とともに増加しました。

＜使用製品＞
細胞外ATP 　　　　　：Extracellular ATP Assay Kit-Luminescence （製品コード：E299）
細胞外LDH　　　　　：Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（製品コード：CK12）
細胞増殖　　　　　　：Cell Counting Kit-8（製品コード：CK04）
ホスファチジルセリン：Annexin V Apoptosis Plate Assay Kit（製品コード：AD12）
細胞内Fe²⁺　　　　　：FerroOrange（製品コード：F374）