染色時は下記の点に注意の上、使用してください。

①FerroOrange染色後の培地交換
培地交換によりFerroOrangeが細胞外へ漏れ出てしまうため、染色後はそのまま観察してください。

②コントロール実験
鉄検出の実験条件を確認するため、鉄キレート試薬Bpy(2,2‘-bipyridine)または鉄（硫酸アンモニウム鉄(II) ）を添加したサンプルを準備し、FerroOrangeの蛍光強度の変化をみられることをお勧めします。

③細胞が染色されにくい（感度が低い）時の対応
細胞種によって染色度合いに差がみられる場合があります。
FerroOrange working solution濃度を推奨の1 μmol/lより高くして染色を行ってください。1-5 μmol/lの範囲での染色をお勧めします。

下記の実験例を参考に測定ください。

＜測定サンプル＞
サンプルA：添加剤なし（HeLa細胞のみ）
サンプルB：鉄キレート試薬 2,2'-bipyridyl (Bpy) を添加したHeLa細胞
サンプルC：鉄（硫酸アンモニウム鉄）を添加したHeLa細胞

＜測定操作＞
1. 96ウェルマイクロブラックプレート（透明底）にHeLa細胞懸濁液100 μlを 10,000 cells/wellになるよう播種し、37℃インキュベータ（5% CO₂）で一晩培養した。
2. サンプルCの細胞をMEM（FBS不含） 100 μlで3回洗浄した。
3. サンプルCのウェルに硫酸アンモニウム鉄(II)/MEM（FBS不含）溶液 100 μL(終濃度：100 μmol/l)を添加し、37℃インキュベーター（5% CO₂）中で30分間静置した。
4. 全てのウェルの細胞をHBSS 100 μlで3回洗浄した。
5. サンプルAおよびCのウェルに1 μmol/l FerroOrange working solution 100 μlを添加し、サンプルBのウェルにFerroOrange (終濃度：1 μmol/l)及び Bpy (終濃度：100 μmol/l)を含むHBSS溶液 100 μlを添加し、37℃インキュベータ（5% CO₂）で30分間インキュベートした。
6. プレートリーダーにて各サンプルの蛍光強度（Ex: 543 nm、Em: 580 nm）を検出した。

＜測定データ＞

検出時の推奨フィルターは下記の通りです。
励起フィルター: 530-565 nm
蛍光フィルター: 570-620 nm

可能です。但し、以下の理由より実験条件の最適化を行う必要があります。

　・細胞密度や細胞の種類によっては、FerroOrangeの染色強度に影響を与える場合があります。
　・培地交換や洗浄により、色素が細胞外に漏れる場合があります。

(参考)
HeLa細胞を用いた実験例をご紹介致します。

＜操作＞
1. MEM（10％ FBS、1％ penicillin-streptomyci）培地に懸濁したHeLa細胞を6ウェルプレートに播種し（1 x10⁵ cells／well）、37℃、5％CO₂インキュベーター中で一晩培養した。
2. 細胞を無血清培地（2 ml）で3回洗浄し、無血清培地（1 ml）を細胞に添加した。
3. 10 mmol/l 硫酸鉄（II）アンモニウム（10 μl）をウェルに添加した（終濃度：100 μmol/l）。
4. 硫酸鉄アンモニウムと無血清培地を混合するため、ウェル内の溶液全量を一度マイクロピペットで吸い上げ、再び同じウェルにゆっくり戻した。
5. 37℃、5％ CO₂インキュベーター中で20分間インキュベートし、HBSS(1 ml)で3回細胞を洗浄した。
6. トリプシン処理（250 µl）後、血清培地（1 ml）で反応を停止し、細胞懸濁液 1.25 mlを遠心管に移した。
7.  細胞懸濁液を1,500 rpm、3分間遠心分離した。
8. 上清を除去し、HBSS（1 ml）を遠心管に加え、ピペッティングにより懸濁した。
9.  細胞懸濁液を1,500 rpmで3分間遠心し、上清を除去した。
10. 無血清培地で希釈した1 μmol/l FerroOrangeを300 μl細胞に添加した。
11. 37℃、5％ CO₂インキュベーター中で15-30分間インキュベートした。
12. 細胞をセルストレーナーに通し、フローサイトメーターを用いて解析した。

＜注意点＞

1. 染色後の洗浄によりFerroOrangeが細胞外に漏出するため、染色後洗浄をせずに測定してください。

（染色後の洗浄有無による蛍光強度の差）
  

2.  色素溶液の量に依存して蛍光強度が変化することがあるので、等量の色素溶液を添加してください。

　(色素溶液量による蛍光強度の差)
   

3. 鉄(II)を検出する実験条件を確認するために、硫酸鉄(II)アンモニウムを含む試料を調製し、
　　FerroOrangeの蛍光強度の変化を確認することを推奨します。
 

固定した場合にはFerroOrangeのシグナルが得られなくなり、正確な細胞内の鉄(II)イオンの変化が確認できなくなるため、推奨いたしません。

（ 参考 ）
硫酸アンモニウム鉄(II)(終濃度：100 μmol/l)を添加したHepG2細胞を未固定、15分間固定処理、30分間固定処理した細胞にFerroOrange Working solutionを添加し、蛍光顕微鏡にて観察しました。

＜検出条件＞
Ex: 561 nm(1.50 %)
Em: 550-650 nm 
Gain: 700 V
Scale bar: 20 µm

可能です。プロトコルは、以下をご参照ください。

【 実験例 】
硫酸アンモニウム鉄(II)(終濃度：100 μmol/l)を添加したJurkat細胞にFerroOrange Working solutionを添加し、蛍光顕微鏡にて観察しました。

＜検出条件＞ Ex: 561 nm(1.50 %) Em: 550-650 nm  Gain: 700 V Scale bar: 20 µm

＜プロトコル＞
➀ 3×10⁶ cells/mlのJurkat細胞懸濁液（無血清MEMを使用）をディッシュに播き、10 mmol/l 硫酸アンモニウム鉄(II)溶液を添加した。(終濃度 100 µmol/l)
➁ インキュベーター内（37 ℃, 5 ℃, 5 %CO2存在下）で30 分間インキュベートした。
➂ 1.5 ml tubeに移して遠心し、上清を除去後、HBSSで1回洗浄した。
④ 遠心し上清を除去後、1 µmol/l FerroOrange working solutionを添加し、ibidi 8-well plateに移した。
⑤ インキュベーター内（37℃, 5℃, 5%CO2存在下）で30 分間インキュベートした。
⑥ 蛍光顕微鏡で観察した。

血清の影響が考えられます。
血清入りの培地を使用した場合、無血清の培地と比較してバックグラウンドが上昇することを確認しております。

( 参考 )
10 µM Erastinで24時間処理したA549細胞に、血清入り培地、無血清培地でそれぞれ調整したFerroOrange Working solutionを添加し、蛍光顕微鏡にて観察しました。

＜検出条件＞ Ex: 561 nm(1.50 %) Em: 550-650 nm  Gain: 700 V Scale bar: 20 µm