実験例：t-BHP (tert-butyl hydroperoxide) 処理した HepG2細胞の脂質過酸化の検出

本色素で染色後のHepG2 細胞に、200 µmol/l t-BHPを含むHBSS溶液を添加し2時間の刺激を与え、未刺激の細胞との蛍光強度を比較しました。結果、未処理の細胞に比べ t-BHP 添加の細胞では、赤色蛍光の減少と緑色蛍光の増加が高感度に確認されました。また、この細胞をプレートリーダーを用いて検出し、得られた数値を緑色/赤色蛍光の強度比で算出したところ、脂質過酸化を数値化できました。さらに、フローサイトメーターで検出した場合、緑蛍光のヒストグラムが増加していることも確認できました。本色素は、異なる3つの分析器を用いて解析することが可能であることがわかりました。

＜検出条件＞
検出装置：蛍光顕微鏡
Green: GFP filter (Ex = 450-490 nm, Em = 500-550 nm)
Red: TexasRed filter (Ex = 540-580 nm, Em = 600-660 nm)
Scale bar: 50 µm

＜検出条件＞
検出装置：蛍光プレートリーダー
Green: Ex = 490 nm, Em = 520-540 nm
Red: Ex = 570 nm, Em = 600-620 nm

＜検出条件＞
検出装置：フローサイトメーター
Filter: FITC (Ex = 488 nm, Em = 515-545 nm)

実験例：Cumene hydroperoxide処理におけるHepG2細胞の脂質過酸化の検出

本色素で染色後のHepG2 細胞に、200 µmol/l cumene hydroperoxide を含むHBSS溶液を添加し2時間の刺激を与え、未刺激の細胞との蛍光強度を比較しました。結果、未処理の細胞に比べ cumene hydroperoxide 添加の細胞では、赤色蛍光の減少と緑色蛍光の増加が確認され、脂質過酸化を検出できていることがわかりました。

＜検出条件＞
検出装置：蛍光顕微鏡
Green: GFP filter (Ex = 450-490 nm, Em = 500-550 nm)
Red: TexasRed filter (Ex = 540-580 nm, Em = 600-660 nm)
Scale bar: 50 µm

実験例：Erastin 処理した HepG2細胞の脂質過酸化の検出

10 µmol/l Erastin を含むMEM培地を添加し2時間の刺激を与えたHepG2 細胞と、未刺激の細胞を本色素を用いて比較しました。結果、未処理の細胞に比べ刺激有りの細胞では、赤色蛍光の減少と緑色蛍光の増加が確認され、脂質過酸化を検出できていることがわかりました。

＜検出条件＞
検出装置：共焦点レーザー顕微鏡
Green: Ex = 488 nm, Em = 510-550 nm
Red: Ex = 561 nm, Em = 600-630 nm)
Scale bar: 50 µm

実験例：植物細胞(タバコ BY-2細胞)内の脂質過酸化の検出

植物細胞(タバコ BY-2細胞)にストレス刺激^※を2時間行った際の過酸化脂質の検出を行いました。
結果、刺激を行っていない細胞 (Control) に比べ、刺激剤処理群では優位な蛍光輝度の上昇が観察されました。
※刺激の条件は論文執筆中のため、非公開

<操作手順>
・BY-2 細胞懸濁液を必要量準備する
・1.5 mL チューブに細胞懸濁液を1 mL入れる
・1 mmol/l の Liperfluo DMSO stock solutionを2 µL (終濃度 2 µmol/l、x500希釈)添加する
・30分間静置し、細胞を沈殿させる
・静置後、細胞を舞い上げないように上澄みを900 µL除く
・LS 培地を900 µL添加する
・刺激剤、コントロール(DMSO等)を適量添加する
・チューブをラップ、アルミホイルで覆い、シェイカーに設置
・シェイカーにて 2 時間培養する
・スピニングディスク式共焦点顕微鏡 (CSU-X1) にて観察する
　対物レンズ: 10倍、励起レーザー: 488 nm, 555 nm、露光時間: 500 ミリ秒

「データ提供：平瀬 一真（熊本大学理学部・4年生）、檜垣 匠（熊本大学理学部・教授）」