実験例：ミトコンドリアスーパーオキシドと膜電位の同時測定

HeLa細胞をHBSSにて洗浄後、MitoBright ROS Deep Redと小社ミトコンドリア膜電位染色色素(JC-1 : 製品コードMT09もしくはMT-1: 製品コードMT13)を用いて共染色し、発生したミトコンドリアROSと膜電位を同時に観察しました。
その結果、いずれの条件でもミトコンドリアROSの発生に伴うミトコンドリア膜電位の低下を同時に観察することが出来ました。

＜JC-1を用いた実験操作＞

検出条件（共焦点レーザー蛍光顕微鏡）
JC-1 ：緑 Ex = 488, Em = 490-520 nm, 赤 Ex = 561, Em = 560-600 nm
MitoBright ROS ：Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm
スケールバー：10 µm

検出条件（マイクロプレートリーダー）Tecan, Infinite M200 Pro
JC-1 ：緑 Ex = 480-490 nm, Em = 525-545 nm, 赤 Ex = 530-540 nm, Em = 585-605 nm
MitoBright ROS ：Ex = 545-555 nm, Em = 665-685 nm

＜MT-1を用いた実験操作＞

検出条件（共焦点レーザー蛍光顕微鏡）
MT-1： Ex = 561, Em = 560-600 nm
MitoBright ROS： Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm
スケールバー：10 µm

検出条件（マイクロプレートリーダー）Tecan, Infinite M200 Pro
MT-1： Ex = 540-550 nm, Em = 590-610 nm (Gain = 200)
MitoBright ROS ：Ex = 545-555 nm, Em = 665-685 nm

実験例：細胞内Total ROSとミトコンドリアスーパーオキシドの同時測定

HeLa細胞をHBSSにて洗浄後、MitoBright ROS Deep Redと小社細胞内ROS検出色素（ROS Assay Kit –Highly Sensitive DCFH-DA-：製品コード R252）を用いて共染色し、ミトコンドリアスーパーオキシド発生剤（Antimycin）もしくは過酸化水素による異なる刺激を誘導し、観察を行いました。
その結果、細胞全体でのROS 誘導とミトコンドリア由来の ROS誘導を見分けることが観察できました。

実験操作

過酸化水素刺激の結果

Antimycin刺激の結果

検出条件（共焦点レーザー蛍光顕微鏡）
細胞内 ROS： Ex = 488, Em = 490-520 nm
MitoBright ROS ：Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm
スケールバー：10 µm

実験例：ミトコンドリア量、ミトコンドリア膜電位、ミトコンドリアスーパーオキシドの同時解析

核染色試薬(Hoechst33342: 製品コードH342)とミトコンドリア量検出色素(MitoTracker^TM Green FM)、ミトコンドリア膜電位検出色素(Tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE))を用いて染色したHeLa細胞をHBSSにて洗浄後、Antimycinを含むMitoBright ROS Deep Red working solutionを用いて染色し、発生したミトコンドリアROSと膜電位、ミトコンドリア量、核を同時に観察しました。
その結果、ミトコンドリア量の変化が無い状態で、ミトコンドリアROSの発生に伴うミトコンドリア膜電位の低下を同時に観察することが出来ました。

＜検出条件＞
検出器：共焦点レーザー顕微鏡
（青）核：Hoechst33342 (Ex = 405 nm, Em = 450-495 nm)
（緑）ミトコンドリア量：MitoTracker^TM Green FM (Ex = 488 nm, Em = 500-550 nm)
（赤）ミトコンドリア膜電位：TMRE (Ex = 561 nm, Em = 560-620 nm)
（紫）ミトコンドリアスーパーオキシド：MitoBright ROS Deep Red (Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm)

スケールバー：10 µm

実験例：老化細胞のミトコンドリアのスーパーオキシドを検出する

-自家蛍光(リポフスチン)の影響を極力抑えて観察するコツ-
 

細胞老化研究におけるリポフスチンの影響
老化した細胞は、リポフスチンと呼ばれるリソソームで分解しきれなかった酸化損傷タンパク質やミトコンドリアが不溶性物質としてリソソームに蓄積することが知られており、蛍光観察時のバックグラウンド上昇の要因となります。細胞老化研究ではリポフスチン等を含む自家蛍光の影響を極力抑えて観察する必要があります。

試薬による違い
老化細胞のミトコンドリアのスーパーオキシドを検出する際の試薬による自家蛍光の影響の違いについてご紹介します。T社製品と小社MitoBright ROS Deep Red - Mitochondrial Superoxide Detectionを用い、TIG-1細胞（ヒト胎児肺由来線維芽細胞）の増殖細胞(継代数2)と老化細胞(継代数14)のミトコンドリアのスーパーオキシドを観察しました。
その結果、T社製品(染色濃度:5 μmol/l)の場合、増殖細胞と老化細胞共にミトコンドリア由来の糸状の蛍光以外に球状の蛍光が多く観察されました。この球状の蛍光は、未染色の細胞の観察画像より自家蛍光であることがわかりました。一方でMitoBright ROS Deep Red(染色濃度:1 μmol/l)を用いた場合は、自家蛍光の影響が少ない状態でミトコンドリアのスーパーオキシド由来の蛍光を観察できました。このことから、特に老化細胞を蛍光観察する際は、色素の感度や波長、蛍光顕微鏡の波長などを考慮して自家蛍光を極力抑えて対象を観察することが重要であることがわかりました。


※細胞によってMitoBright ROSの至適濃度が異なります。染色濃度による自家蛍光の影響の違いについては、
  よくある質問 老化細胞を観察するとミトコンドリア以外の蛍光が観察されます。何を気を付ければいいですか？をご覧ください。　

＜データ提供＞
地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター　藤田 泰典 先生

＜参考文献＞
Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito and I. Ohsawa, “Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts",  Exp. Gerontol., 2022, 165, 111866.

蛍光特性